GABAB受体表达和纯化及膜转运蛋白YajR结构和功能研究

摘要

γ-氨基丁酸(GABA)是中枢神经系统中一种主要的抑制性神经递质，其代谢型受体GABAB受体属于C家族G蛋白偶联受体（GPCR）。GABAB受体参与中枢神经系统中多种神经活动并发挥重要功能，其功能障碍会导致焦虑、癫痫、抑郁、痉挛、药物成瘾以及认知损伤等多种神经疾病。
　　GABAB受体发挥功能由GBR1和GBR2两个亚基形成异元二聚体，每个亚基都由胞外的捕蝇夹（Venus flytrap，VFT）、七次跨膜螺旋和胞内卷曲-螺旋（coiled-coil）三个结构域构成。已知所有 GABAB受体的配体都只结合在GBR1的VFT，最终在胞内GBR2和Gi/o蛋白相互作用完成胞外信号向胞内传递。但是GABAB受体的配体结合特异性，变构调节，二聚化以及胞内卷曲-螺旋结构域屏蔽GBR1内质网滞留的分子机制仍不清楚。在论文的第一研究部分，利用多种蛋白表达系统，表达和纯化GABAB受体全长以及三个结构域，并进行了晶体筛选得到了初步晶体。首先，利用大肠杆菌以包涵体的形式表达了鼠源和线虫的GABAB受体的VFT，通过变复性得到了可溶的GBR1和GBR2 VFT，进行了晶体筛选。利用大肠杆菌表达得到了大量的GBR1 C-末端和GB2R C-末端，用GST-pull down和分子排阻层析（SEC）证明了GBR1 C-末端和GBR2 C-末端相互作用，并进行了广泛的晶体筛选。利用昆虫表达系统表达了GABAB受体 VFT、TMs、VFT-TMs以及全长，通过蛋白质工程融合T4溶菌酶（T4L）或者细胞色素b562（Bril）提高GABAB受体的表达量，改善蛋白均一性，利用常规的气相扩散悬滴法和脂立方相（LCP）法进行晶体筛选，得到了初步晶体。表达和纯化GABAB工作为以后纯化性质更好的GABAB受体提供了参照，而我们得到的GABAB受体跨膜区的初步晶体通过更深入的晶体优化很可能改善晶体的堆积，从而更好的衍射X-光，达到收集数据的水平。
　　膜转运蛋白（Transporters）是细胞生命进程中摄取必要营养物质、离子和排出代谢产物、有害物质的通道，并能使其与环境进行交流。另外，膜转运蛋白也是细胞能量产生和能量消耗的基本组成部分。Major Facilitator Superfamily（MFS）是生物中最大的一类次级主动转运蛋白，超过一万个的MFS转运蛋白广泛分布在所有生物物种中。自2003年第一个MFS晶体结构——乳糖通透酶（Lactose permease，LacY）三维结构报道以来，已经有超过10个处于不同构象的MFS晶体结构被解析。尽管这些结构为MFS转运底物的“摇杆开关模型（Rocker-Switch）”提供强有力的证据，但是底物转运的结构基础和构象转变的能量耦合机制仍不清楚。为了解释上述问题，在论文的第二研究部分，对MFS转运蛋白YajR晶体结构进行研究。
　　YajR是一个分布于许多革兰氏阴性菌的依靠质子驱动的转运蛋白。我们利用大肠杆菌重组表达了YajR，用DDM等多种去垢剂从细胞膜中提取蛋白，利用金属螯合层析、分子筛等纯化手段得到高纯度、均一性的蛋白，然后用气相扩散悬滴法筛选到晶体，再对晶体进行广泛的优化成功得到了高质量的YajR晶体。通过在同步辐射收集YajR晶体对X-射线的衍射数据，利用双波长反常散射法解析了YajR3.15?分辨率的三维结构。结构分析表明，YajR结构包含两个部分——12次跨膜螺旋区和胞内YAM区。跨膜区的折叠方式跟其他MFS蛋白类似，由螺旋1-6组成的N-结构域和由螺旋7-12组成的C-结构域有一个垂直于细胞膜的对称轴；N-结构域的螺旋1、2、3和螺旋4、5、6有一个平行于细胞膜的对称轴，类似的对称轴还存在于C-结构域的螺旋7、8、9和螺旋10、11、12。螺旋1、4、7、10围绕构成中央腔，紧接着螺旋2、5、8、11围绕为其提供支撑，螺旋3、6、9、12围绕在外侧与膜脂相互作用。YAM的折叠方式类似于铁氧还蛋白，即βαββαβ，不过YAM缺失了最后一β丝带。YajR的N-和C-结构域在细胞内侧靠近闭合、在细胞外侧远离打开。因此，YajR处于外向开口（Outward Facing）构象。通过序列比对和结构分析，发现利用得到的YajR外向开口的结构可以很好的解释MFS蛋白最保守的模体“motif A”在稳定外向开口构象发挥的作用，并由此提出一个MFS蛋白在转运底物时内向和外向状态之间构象变化的通用机制。

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1 绪论

1.1 GABAB受体结构和功能

1.2 本课题主要研究内容

2 实验原理和方法

2.1克隆构建

2.2易错PCR

2.3蛋白质表达

2.4蛋白质纯化

2.5 蛋白质结晶筛选

3 GABAB受体克隆、表达、纯化和晶体筛选

3.1 GABAB受体氨基酸序列的生物信息学分析

3.2 GABAB受体在E. coli中表达纯化

3.2 GABAB受体胞外区包涵体变复性

3.3 用易错PCR（error-prone PCR）建立GABAB受体胞外区突变库

3.4 GABAB受体在昆虫细胞中表达纯化

3.4 讨论和展望

4 绪论

4.1 转运蛋白分类和功能

4.2 MFS分类

4.3 MFS结构特性

4.4 MFS转运机制

4.5 YajR基本信息

4.6 本课题主要研究内容

5 实验原理和方法

5.1 用E. coli蛋白质表达膜蛋白

5.2 硒代膜蛋白的培养

5. 3 膜蛋白纯化

5. 4 膜蛋白晶体筛选

5.5 膜蛋白晶体结构解析

5.6 热-荧光法（ThermoFluorescence）检测膜蛋白热稳定性

5.7 膜蛋白半胱氨酸交联

6 YajR表达、纯化、结晶和晶体结构测定

6.1 E.coli(BL21) YajR表达、纯化和结晶

6.2 YajR数据收集、处理和结构解析修正

6.3 YajR结构分析

6.4 讨论和展望

7 全文总结与展望

致谢

参考文献

附录1 主要符号和缩略词表

附录2 就读期间科研成果