飞龙掌血镇痛抗炎活性成分及其作用机制研究

摘要

飞龙掌血Toddalia asiatica Lam.为芸香科（Rutaceae）飞龙掌血属（Toddalia）植物，在我国的地理位置分布为秦岭以南各地。味辛、微苦，性温，具有祛风除湿、散瘀止血、消肿解毒的功效。飞龙掌血主要用来治疗跌打损伤、风湿骨痛、腰痛、痛经以及毒蛇咬伤等病症，效果显著，且民间用于治疗类风湿性关节炎（RA）的药用历史悠久。生物碱类与香豆素是该植物中的两大类主要成分，关于其发挥镇痛抗炎作用的活性成分及作用机制的报道均较少。本课题拟进一步研究飞龙掌血的镇痛抗炎活性部位和活性单体成分，并考察其发挥镇痛抗炎作用的机制。
　　一．飞龙掌血各部位的免疫调节作用及其镇痛抗炎活性的研究
　　将药材粗粉采用热回流提取得到总膏，依次萃取得生物碱部位和乙酸乙酯部位（将其进一步分为EⅠ、EⅡ、EⅢ三个部位）并作为研究对象，实验内容及结果如下：
　　1．免疫调节作用的考察：生物碱部位和乙酸乙酯部位对刀豆蛋白A和脂多糖诱导小鼠脾脏T、B淋巴细胞增殖的作用进行MTT检测，然后对T细胞CD4与 CD8亚群进行流式检测，结果表明它们均能通过改变 T淋巴细胞（CD4+、CD8+）的数目或亚群来调节机体的免疫功能。
　　2．体内镇痛抗炎活性研究：采用小鼠醋酸扭体、热板法和二甲苯致小鼠耳肿胀三个实验，结果显示生物碱部位、乙酸乙酯部位及其EⅠ部位具有较好的镇痛及抗炎活性，能显著抑制小鼠的扭体反应和耳肿胀程度，降低痛阈值。同时采用纳洛酮拮抗实验和利血平影响实验初步考察其镇痛机制，结果表明生物碱部位的镇痛作用受到利血平的拮抗，而乙酸乙酯及其EⅠ部位的镇痛作用部分被纳洛酮拮抗。
　　3．抗RA活性研究：采用Ⅱ型胶原建立CIA小鼠模型，检测各部位对CIA小鼠的体重、足肿胀程度、脾脏指数、关节病理变化及评分、血清中细胞因子水平的影响，结果表明生物碱部位和乙酸乙酯EⅠ部位对CIA模型均具有显著的改善作用，能通过缓解脾脏肿大及调节肿瘤坏死因子-α与白介素-17、-6、-10四种因子的水平而改善其足垫和踝关节的肿胀，抑制滑膜和软骨的异常增生与侵蚀等。
　　二．飞龙掌血的体外抗炎活性及机制的研究
　　以飞龙掌血浸膏及部分单体化合物（香豆素和生物碱）为研究对象，实验内容及结果如下：
　　1．对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞增殖的影响：采用MTT法研究其对该模型是否具有细胞毒作用，结果表明其总膏、生物碱部位和乙酸乙酯EⅠ部位以及茴芹内酯、toddaculin、异茴芹内酯、氧化白屈菜碱在高浓度时具有一定的细胞毒性，而omphalocarpin、二氢白屈菜红碱、茵芋碱、γ-花椒碱均无明显的细胞毒性。
　　2．对NO水平的调节：采用Griess法检测它们对细胞培养上清液中NO水平的影响，结果显示除茴芹内酯、toddaculin、异茴芹内酯、氧化白屈菜碱以外，其余成分均具有一定的NO抑制作用。
　　3．对TNF-α、IL-6、COX-2和iNOS水平的影响：采用ELISA法检测细胞培养上清液中几种炎症介质水平的变化，结果表明飞龙掌血总膏、生物碱部位和乙酸乙酯EⅠ部位以及omphalocarpin、茵芋碱均可显著下调这几种因子的水平。
　　4．茵芋碱与omphalocarpin对COX-2、iNOS的表达以及NF-κB通路的影响：采用Western Blotting法，结果显示二者均能显著抑制COX-2和iNOS两种蛋白的表达及 NF-κB的转录活性（抑制胞浆中 IκB-α蛋白的磷酸化以及 NF-κB p65蛋白易位至细胞核的水平），说明它们可能通过抑制 NF-κB的转录活性下调各种炎性介质如NO、TNF-α、IL-6、COX-2和iNOS的水平。
　　5．对RA成纤维样滑膜细胞（FLS）的增殖及其释放MMP-3和IL-1β的影响：采用CCK-8法研究对RA FLS增殖的作用，并运用流式细胞术检测其对细胞周期的影响，ELISA法检测MMP-3和IL-1β的水平，结果表明飞龙掌血总膏、生物碱部位和乙酸乙酯EⅠ部位以及茵芋碱、omphalocarpin均能使细胞大量停留于DNA合成前期，从而抑制 TNF-α诱导 RA FLS增殖的程度，同时明显下调RA FLS分泌MMP-3和IL-1β的水平。
　　三．主要化学成分的镇痛抗炎活性研究
　　以茴芹内酯、异茴芹内酯、omphalocarpin和茵芋碱四个主要成分为研究对象，实验内容及结果如下：
　　1．体内镇痛抗炎活性研究：采用小鼠醋酸扭体、热板法和二甲苯致小鼠耳肿胀三个实验，结果显示茵芋碱与omphalocarpin具有较好的活性，能显著抑制小鼠的扭体反应和耳肿胀程度，降低痛阈值。同时采用纳洛酮拮抗实验和利血平影响实验初步考察其镇痛机制，结果表明二者的镇痛作用受到利血平的拮抗，而不受纳洛酮的影响。
　　2．抗 RA活性研究：采用Ⅱ型胶原作为诱导剂以建立关节炎小鼠模型，检测单体成分对CIA小鼠的体重、足肿胀程度、脾脏指数、关节病理变化及评分、血清中细胞因子水平的影响，结果表明茵芋碱对CIA小鼠的关节症状具有明显的缓解作用，能通过减轻脾脏肿大及调节肿瘤坏死因子-α与白介素-1β、-6、-10的水平而改善其足垫和踝关节的肿胀，抑制滑膜和软骨的异常增生与侵蚀等。
　　本课题进一步明确了飞龙掌血的镇痛抗炎活性成分及其机制，并首次筛选了飞龙掌血中主要单体成分的镇痛抗炎活性及抗RA作用；首次采用T、B淋巴细胞的体外增殖模型研究了飞龙掌血的免疫调节作用；首次采用纳洛酮拮抗实验和利血平影响实验初步考察了各活性成分的镇痛作用机制；同时首次通过 LPS诱导RAW264.7巨噬细胞增殖和TNF-α诱导大鼠RA FLS增殖的模型深入探究了飞龙掌血的抗炎作用机制。以上结果说明飞龙掌血可能是通过抑制与RA相关的各种细胞中 NF-κB的转录水平，进而调节这些细胞对炎性介质的释放并抑制与炎症相关的酶的活性和表达，从而影响参与RA的免疫细胞如巨噬细胞的增殖与活化，以及RA中出现特征性病变的滑膜组织中滑膜细胞的增殖与活化，从不同角度改善RA中的炎症免疫反应。总之，民族药飞龙掌血对RA具有很好的治疗作用。

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前言

第一章 飞龙掌血各部位免疫调节作用与镇痛抗炎活性研究

第一节 飞龙掌血总膏及各部位浸膏的分离与制备

一．药材的来源及鉴定

二．实验试剂及主要仪器

三．植物的提取流程

第二节 对正常小鼠免疫功能的调节作用

一．小鼠脾淋巴细胞的增殖实验

二．小鼠脾淋巴细胞T细胞亚群的测定

三．讨论

四．小结

第三节 镇痛及急性抗炎活性的研究

一．镇痛活性的研究

二．急性抗炎活性的研究

三．讨论

四．小结

第四节 飞龙掌血各部位的抗RA活性及其机制

一．实验材料

二．实验方法

三．实验结果

四．讨论

五．小结

第二章 飞龙掌血的体外抗炎活性及机制研究

第一节 对LPS诱导巨噬细胞的抗增殖及抗炎作用

一．对LPS诱导小鼠RAW 264.7巨噬细胞增殖的影响

二．对LPS诱导巨噬细胞产生NO的影响

三．对LPS诱导巨噬细胞产生炎性因子的影响

四．活性单体成分对iNOS和COX-2表达及NF-κB通路的影响

第二节 对TNF-α诱导RA FLS抗增殖及抗炎作用

一．对TNF-α诱导RA FLS增殖的抑制作用

二．对TNF-α诱导RA FLS细胞周期及炎性因子释放的影响

第三章 飞龙掌血中主要化学成分的镇痛抗炎活性研究

第一节 主要化学成分的镇痛活性研究

一．小鼠的醋酸扭体实验

二．热板法

三．镇痛机制的初步考察

第二节 主要化学成分的急性抗炎作用

一．实验动物

二．实验药品

三．实验分组及剂量

四．实验步骤

五．实验结果

第三节 主要化学成分的抗RA活性及其机制

一．实验材料

二．实验方法

三．实验结果

四．讨论

五．小结

第四章 实验结果、讨论与创新点

一．实验结果与讨论

二．研究意义和创新点

参考文献

第五章 类风湿性关节炎相关机制的研究（综述）

致谢

附录