氧化应激在石英粉尘致支气管上皮细胞凋亡和自噬中的作用

摘要

石英粉尘是我国主要的职业有害因素，长期吸入可导致以矽肺为代表的呼吸系统疾病的发生。虽已广泛研究，但石英的致病机制至今仍不完全清楚，直接影响疾病的预防和治疗。研究发现，细胞凋亡和自噬在大气颗粒物和纳米矽尘致机体损害中发挥着重要作用，由此推测细胞凋亡和自噬可能是石英粉尘引起健康损害作用的重要过程。既往研究发现石英粉尘可在呼吸系统引起氧化应激，后者在石英粉尘导致的肺炎性和肺纤维化发生发展中具有重要作用。同时，已有报道认为氧化应激在高糖、缺血再灌注等刺激下增强细胞的凋亡和自噬程度。由此我们提出假说，石英粉尘引起的氧化应激可能介导细胞凋亡和自噬，造成其后续的其它损害。本研究以人正常支气管上皮细胞16HBE为靶细胞，采用呼吸性石英粉尘对其进行染毒，探讨石英粉尘导致的氧化应激与细胞凋亡和自噬的关系。
　　目的：观察石英粉尘诱导人正常支气管上皮细胞的细胞毒性作用、氧化应激及其是否诱导细胞凋亡和自噬，并探讨氧化应激在石英粉尘诱导支气管上皮细胞凋亡和自噬中的作用。
　　方法：首先采用呼吸性纯石英粉尘（粒径<2μm，平均粒径1μm），以37.5、75、150、300μg/mL浓度染尘16HBE细胞24h后，采用CCK-8法检测细胞活力，分光光度计法检测乳酸脱氢酶（LDH）活力，黄嘌呤氧化酶法检测超氧化物歧化酶（SOD）活力，Annexin V-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡率，荧光实时定量PCR法检测Cyt C、Caspase-3、Bax、Bcl-2等细胞凋亡相关基因和LC3、Beclin1、Atg5等自噬相关基因mRNA相对表达水平，蛋白免疫印迹分析法Western blot检测LC3、Beclin1、Atg5等自噬相关蛋白表达水平。检测上述浓度染尘1.5、3、6、12h后细胞内活性氧（ROS）水平。然后使用抗氧化剂NAC（N-乙酰-L-半胱氨酸）进行干预，将实验分为四组，对照组、150μg/mL石英组、NAC组、150μg/mL石英+NAC组，染毒16HBE细胞后，检测细胞活力，ROS水平，细胞凋亡率，Cyt C、Caspase-3、Bax、Bcl-2等细胞凋亡相关基因和LC3、Beclin1、Atg5等自噬相关基因mRNA相对表达水平。
　　结果：随石英粉尘浓度升高，细胞活力、SOD活力下降，LDH活力升高，细胞凋亡率升高。细胞内ROS水平在染尘1.5、3、6h时间点随染尘浓度的升高而升高，ROS水平在1.5 h达到最高，而后逐渐降低，12h到达基线水平。随着染尘浓度的升高，染尘组促细胞凋亡基因Cyt C、Caspase-3、Bax和自噬相关基因LC3、Beclin1、Atg5 mRNA相对表达水平呈升高趋势，抗细胞凋亡基因Bcl-2 mRNA相对表达水平呈降低趋势，LC3、Beclin1、Atg5蛋白相对表达水平升高。
　　与石英组相比，石英+NAC组细胞活力明显升高，ROS水平明显下降，细胞凋亡率明显下降，Cyt C、Caspase-3、Bax等促细胞凋亡相关基因和LC3、Beclin1、Atg5等自噬相关基因mRNA相对表达水平明显下降，抗细胞凋亡基因Bcl-2 mRNA相对表达水平明显升高。
　　结论：石英粉尘可诱导16HBE细胞发生细胞毒性作用、氧化应激、细胞凋亡和自噬。氧化应激参与石英粉尘诱导的支气管上皮细胞凋亡和自噬，抑制氧化应激后减轻细胞凋亡和自噬程度。

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前言

第一部分 石英粉尘对支气管上皮细胞氧化应激、细胞凋亡和自噬的影响

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第二部分 氧化应激在石英粉尘致16HBE细胞凋亡和自噬中的作用

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

结论

创新点

下一步研究计划

参考文献

综述: 自噬与肺部疾病关系的研究进展

附录硕士研究生期间工作小结

致谢