吡格列酮对高脂追赶生长大鼠GLP-1分泌障碍的影响及二甲双胍对NCI-H716细胞脂质代谢相关酶和胰岛素信号通路的影响

摘要

第一部分、吡格列酮对高脂追赶生长大鼠GLP-1分泌障碍的影响及其可能机制
　　目的：
　　观察高脂追赶生长对GLP-1分泌障碍的影响及给予吡格列酮干预后的影响，并探讨其可能机制。
　　方法：
　　72只6周龄Sprague-Dawley雄性大鼠，适应性喂养1周，随机分为：正常对照组（normal control group，NC，n=36）和追赶生长组（catch-up growth，CUG，n=36）。NC组给予正常普通饮食喂养6周；CUG组给予普通饮食喂养6周，但进食量为NC组同体重大鼠进食量的60％。6周后，NC组随机分为正常对照组（n=12）、高脂组（high fat，HF，n=12）；CUG组随机分为追赶生长组（n=12）、追赶生长加吡格列酮干预组（catch-up growth withpioglitazone，CUGP，n=12）。NC组予以普通饲料，自由摄食8周；HF组和CUG组给予高脂饲料，自由摄食8周；CUGP组给予高脂饲料，自由摄食8周，同时给予吡格列酮（100mg/kg）灌胃干预，每日一次。NC组、HF组、CUG组给予等量生理盐水灌胃处理。6周末和14周末分别取部分大鼠进行以下检测：（1）采用生化及ELISA法检测血清游离脂肪酸、甘油三酯、GLP-1水平；（2）采用高胰岛素-正糖钳夹实验测定葡萄糖输注率评价胰岛素敏感性；（3）采用免疫组化染色法观察回肠末端GLP-1染色阳性细胞数量。
　　结果:
　　（1）限食期末，追赶生长组与正常组相比，血清TG、FFA水平较正常组均降低。高脂追赶后，高脂组和追赶生长组血清TG、FFA水平迅速升高，明显高于正常组和吡格列酮组，而正常组和吡格列酮组之间无明显差别。
　　（2）限食期末，追赶生长组与正常组相比，基础和餐后GLP-1分泌均较正常组低。高脂追赶后，高脂组空腹GLP-1水平明显高于其他各组，其他组间则未见明显变化。高脂组和追赶生长组餐后GLP-1（7-36）水平均明显低于正常组，吡格列酮干预后餐后GLP-1水平较追赶生长和高脂组明显升高，接近NC组水平。
　　（3）限食期末，正常组高胰岛素-正糖钳夹实验下葡萄糖输注率（GIR）与追赶生长组无显著差异。追赶生长末，追赶生长组和高脂组葡萄糖输注率明显低于正常组，吡格列酮干预后葡萄糖输注率明显升高，接近正常组水平。
　　（4）限食期末，追赶生长组高倍镜视野内GLP-1染色阳性细胞数较正常组少。高脂追赶后，高脂组和追赶生长组每高倍镜视野中GLP-1染色阳性细胞数急剧减少，明显低于正常组，吡格列酮干预后明显增加了每高倍镜视野中GLP-1阳性细胞数目，但仍未达到正常组水平。
　　结论:
　　高脂追赶生长会导致GLP-1分泌和肠道L细胞数量的减少，吡格列酮干预后可能通过改善胰岛素抵抗和脂质代谢异常从而改善GLP-1分泌障碍，并提高肠道L细胞数量。
　　第二部分、二甲双胍对NCI-H716细胞脂质代谢相关酶和胰岛素信号通路的影响
　　目的：
　　观察游离脂肪酸升高对 L细胞脂质代谢酶及胰岛素信号通路的影响，并观察给予二甲双胍干预后的影响。
　　方法：
　　将NCI-H716细胞在含有10%胎牛血清和1%青/链霉素的RPMI1640培养基中培养，实验前两天将细胞接种到预先铺好基质胶的培养板中（诱导分化），然后进行如下分组处理：
　　1、不含软脂酸（PA）的对照组（NC组）和软脂酸(PA)干预组：PL组（0.125mM PA）、PM组（0.25mM PA）、PH组（0.5mM PA），以及二甲双胍(Met)干预组：M1组（0.125mM PA+0.5mM Met）、M2组（0.125mM PA+1.0mM Met）、M3组（0.125mM PA+2.0mM Met）；吡格列酮（Pio）干预组：P1（0.125mMPA+1uM Pio）、P2（0.125mM PA+10uM Pio）、P3（0.125mMPA+20uM Pio）。干预48小时后采用CCK-8法检测各组细胞活性。
　　2、不含PA的对照组（NC组）和PA干预组：PL组（0.125mM PA）、PM组（0.25mM PA）、PH组（0.5mM PA），以及二甲双胍(Met)干预组：M1组（0.125mM PA+0.5mM Met）、M2组（0.125mM PA+1.0mM Met）、M3组（0.125mM PA+2.0mM Met）。各组分别干预48小时后，采用western blot法检测NCI-H716细胞脂质代谢情况：脂肪酸合成：脂肪酸合成酶（FAS）；脂质氧化：肉毒碱棕榈酰转移酶-1（CPT-1）表达水平。
　　3、分组同2中所述，各组干预48小时后，采用western blot法检测NCI-H716细胞胰岛素信号系统：胰岛素受体、Akt、p-Akt（Ser-473）的表达。
　　结果：
　　（1）PA干预后，NCI-H716细胞活性下降。在PA干预的基础上给予二甲双胍干预，一定浓度的二甲双胍可以保护NCI-H716细胞活性受损；而吡格列酮干预后，对NCI-H716细胞活性无明显影响。
　　（2）PA干预后，NCI-H716细胞内FAS水平显著低于正常对照组，且随着软脂酸的浓度的增加，FAS的水平逐渐降低；而CPT-1的表达随着软脂酸的浓度的增加逐渐增加。在PA处理的基础给予二甲双胍干预后，FAS表达仅在最大二甲双胍干预浓度（2.0mM）组略有上升，但其表达量仍低于正常组；而CPT-1表达随着二甲双胍浓度梯度呈逐渐升高的趋势。
　　（3）PA干预后，各组间胰岛素受体（IR）水平未见明显差异；而Akt和p-Akt/Akt表达随着暴露的PA浓度的增加逐渐下降。在PA处理的基础给予二甲双胍干预后，各干预组IR水平随着二甲双胍浓度梯度逐渐增加；细胞内Akt和p-Akt/Akt的表达，也随着二甲双胍的浓度梯度逐渐升高。
　　结论：
　　游离脂肪酸可以导致NCI-H716细胞活性下降、脂质代谢酶的改变和胰岛素抵抗，二甲双胍干预在一定程度上可以改善其脂质代谢和胰岛素抵抗，而吡格列酮干预未见其对L细胞明显的保护作用。

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声明

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第一部分 吡格列酮对高脂追赶生长大鼠GLP-1分泌障碍的影响及其可能机制

中文摘要

Abstract

前言

材料方法与结果

1.材料与方法

2.动物实验造模和分组

3、各项生理指标检测及方法

4结果

讨论

1.吡格列酮对高脂追赶生长大鼠血脂水平的影响

2. 吡格列酮对高脂追赶生长大鼠系统胰岛素抵抗的影响

3.吡格列酮对高脂追赶生长大鼠GLP-1分泌及肠道L细胞数量的影响

参考文献

第二部分 二甲双胍对NCI-H716细胞脂质代谢相关酶和胰岛素信号通路的影响

中文摘要

Abstract

前言

材料方法与结果

1.材料与方法

2．细胞实验造模及分组

3、各项指标检测及方法

4.结果

讨论

1、FFA升高及胰岛素增敏剂对NCI-H716细胞活性的影响

2、FFA升高及二甲双胍干预对NCI-H716细胞脂质代谢酶表达的影响

3.FFA及二甲双胍干预对NCI-H716细胞胰岛素信号通路的影响

小结

参考文献

综述: L细胞损伤与糖尿病

致谢