MicroRNA-101a通过靶向调控心脏成纤维细胞TGFβRI的表达抑制缺氧诱导的心肌纤维化

摘要

研究背景：缺氧是与多种心血管疾病相关联的基本病理变化，其导致心脏病理性重塑的效应已经得到广泛证实。转化生长因子β（TGF-β）信号通路在调节心脏成纤维细胞（CFs）的生物学功能以及心肌纤维化过程中发挥了非常关键的作用。近期的研究数据表明microRNA-101a（miR-101a）能够抑制心肌梗死后心肌纤维化并且改善了心脏功能。
　　研究目的：本研究旨在探讨心肌组织以及心脏成纤维细胞在缺氧环境中，miR-101a的表达水平与TGF-β信号通路激活的潜在相关性。
　　研究方法及结果：大鼠结扎冠状动脉两周后，大鼠心脏梗死部位以及梗死交界区TGFβ1与TGFβRI的表达水平均升高。而miR-101a在大鼠心脏梗死部位以及梗死交界区表达水平下降。缺氧环境下培养大鼠乳鼠心脏成纤维细胞上调了TGFβ1和TGFβRI的表达水平，同时下调了miR-101a的表达水平。心脏成纤维细胞转染miR-101a mimic（miR-101a化学合成模拟物）显著抑制了心脏成纤维细胞中缺氧诱导的TGFβRI和p-Smad3表达上调（而没有影响TGFβ1的表达）、细胞分化以及胶原蛋白含量的表达增加。这种miR-101a的抗纤维化效应在心脏成纤维细胞共转染AMO-MIR-101a（miR-101a的反义链）能够显著被抑制。TGFβRI3'UTR的荧光素酶报告结果进一步证实了TGFβRI是miR-101a的靶基因之一。此外，我们的研究结果显示心脏成纤维细胞转染miR-101a能够显著抑制缺氧诱导的心脏成纤维细胞迁移，同时进一步增强了缺氧诱导的心脏成纤维细胞增殖抑制效应。
　　结论：我们的研究结果表明miR-101a能够通过直接抑制心脏成纤维细胞TGFβRI的表达而发挥其抗纤维化效应。研究结果同时提示miR-101a在TGF-β信号通路诱导的心脏成纤维细胞致纤维化效应过程中多个层面发挥作用。

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英文缩略词表及中文对照

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前言

实验动物及材料

1. 实验动物

2. 主要实验仪器

3. 主要实验材料

4. 主要试剂

第一部分 动物实验：心肌梗死下调了miR-101a的表达水平并激活了TGF-β信号通路

1.1 构建心肌梗死及假手术大鼠模型

1. 2 心肌组织苏木精-伊红染色(HE)

1.3 心肌组织Masson染色

1.4 心肌组织免疫组织化学染色

1.5 实时定量PCR检测心脏组织 TGFβ1、TGFβRI、Col 1a1、Col 3a1、MMP 2/9 mRNA以及miR-101a的表达水平

1.6 Western blot方法检测组织TGFβ1、TGFβRI、α-SMA蛋白的表达水平

1.7 结果统计分析

实验结果

第二部分 细胞实验：miR-101a通过阻断心脏成纤维细胞TGF-βRI/Smad信号通路抑制缺氧诱导的纤维化效应

2.1. 分离培养SD大鼠乳鼠心脏成纤维细胞

2.2. 心脏成纤维细胞转染miRNAs

2.3. 实时定量PCR检测心脏成纤维细胞 TGFβ1、TGFβRI、Col 1a1、Col 3a1、MMP 2/9 mRNA以及miR-101a的表达水平

2.4. Western blot方法检测心脏成纤维细胞 TGFβ1、TGFβRI、α-SMA、p-Smad 3/Smad 3 蛋白的表达水平

2.5. Sircol Collagen Assay 检测心脏成纤维细胞胶原蛋白的表达量

2.6. 激光共聚焦检测心脏成纤维细胞α-SMA蛋白的表达水平

2.7. 双荧光素酶报告实验

2.8 心脏成纤维细胞迁移实验

2.9. 心脏成纤维细胞增殖实验

2.10. 结果统计

实验结果

讨论

参考文献

图例

综述: microRNAs参与心肌纤维化调控的研究进展

攻读博士学位期间发表的学术论文

致谢