帕金森病中脑黑质组织磷酸化蛋白质组学分析

摘要

目的：帕金森病（Parkinson’s disease，PD)是一种老年人常见的，以静止性震颤，肌强直，运动迟缓，姿势步态异常为主要特征的中枢神经系统退行性疾病，其运动功能的改变是由黑质致密部（SNpc）多巴胺能神经元丢失所引起的。黑质致密区的多巴胺能神经元丢失引起纹状体多巴胺（Dopamine，DA）分泌减少，多巴胺递质的不足使其与兴奋性的乙酰胆碱失去平衡而导致锥体外系功能失调。帕金森病的发病原因和机制十分复杂，可能的因素主要包括年龄因素，遗传性基因缺陷，环境因素，线粒体功能受损，氧化应激和泛素-蛋白酶体功能异常。目前仍有约80％的散发性PD患者未发现明确病因。多项研究认为激酶通路异常可能参与了帕金森病的发病过程，蛋白磷酸化及其相应蛋白激酶在PD发病过程中所起到作用受到越来越多研究者的关注。目前的研究多集中于单个或几个特定的激酶或蛋白磷酸化过程，对于治疗靶点的研究主要以单个激酶为主，尚缺乏系统性的整体研究。本研究应用iTRAQ磷酸化蛋白组学深入研究PD动物模型中磷酸化蛋白与其可能上游激酶之间的关系，运用生物信息学软件预测磷酸化蛋白的潜在上游激酶，绘制基于磷酸化蛋白组学的激酶-底物网络，系统分析 PD中激酶亚群与磷酸化蛋白之间的相互作用，是全面理解蛋白激酶通过磷酸化蛋白参与PD发病的基础，为解决神经系统退行性疾病提供新的思路以及可能的潜在靶点。
　　方法：⑴给予6月龄的Tg(Th-SNCA*A30P*A53T)转基因小鼠腹腔连续注射5天MPTP构建PD动物模型，应用行为学实验，矿场实验和转棒实验来评估各组小鼠的运动能力和探索行为。⑵获取Tg组与对照组小鼠中脑黑质组织通过iTRAQ技术进行磷酸化蛋白定量分析。采用Gene ontology分析磷酸化蛋白组学结果，对有意义的磷酸化蛋白进行归类分析。⑶采用激酶-底物预测软件GPS2.1和Scansite3来预测有意义的磷酸化蛋白的可能的上游激酶，并与质谱检测到磷酸化位点进行比对筛选，确定有意义的潜在上游激酶。按蛋白激酶分类绘制所有磷酸化水平上升的蛋白与其潜在激酶的相互作用网络，并绘制各亚群激酶与相应蛋白的相互作用网络。⑷通过PhosphositePlus分析以及文献检索，对所有有意义的磷酸化蛋白位点进行逐个分析，选取与细胞周期依赖性蛋白激酶5（CDK5）有关的一个突触前膜蛋白Syntaphilin，人工合成11肽，进行体外激酶反应联合质谱验证其磷酸化位点。
　　结果：①采用6月龄的Tg(Th-SNCA*A30P*A53T)转基因小鼠腹腔连续注射5天MPTP构建PD动物模型，通过行为学检验实验组未发现明显的运动能力改变。②采用iTRAQ磷酸化蛋白组学定量分析PD发病过程中有关的磷酸化蛋白。质谱共检测出来自888个蛋白上的2077条肽段。共发现来自138个蛋白上的157条非冗余肽段（其中共183个有效磷酸化位点）在PD动物模型中磷酸化水平显著改变，其中99条肽段在PD模型中磷酸化水平显著上升，58条下降。使用GO分析所有磷酸化水平显著改变的蛋白，并进行分类，发现磷酸化水平显著上调与下调蛋白质在亚细胞定位，分子功能以及生物过程三方面都无明显差异。③采用激酶-底物预测软件GPS2.1和Scansite3来预测有意义的磷酸化蛋白质的可能的上游激酶，使用Cytoscape构建蛋白-激酶互作网络。我们关注PD中磷酸化水平上调的差异表达蛋白质，构建拓扑网络图共包含84条上调组磷酸化蛋白和19个可能激酶，并发现其中激酶主要归于几个大的家族，包括CMGC激酶家族（7个激酶），AGC激酶家族（6个激酶）等，并依据激酶家族分类依次绘制各亚组拓扑网络图，进一步分析其激酶-底物相互作用网络。④CDK家族中特殊的一员，细胞周期素依赖的蛋白激酶5（cyclin-dependent kinase5，CDK5）它的辅助伴侣分子并不是cyclin家族成员，而是P35/p39。研究表明 CDK5的作用主要集中在脑发育早期神经细胞的迁移、轴突的分化，生长及导向，神经系统退行性疾病发病和DNA损伤等病变过程中。鉴于CDK5的重要作用，我们选出一个可能的磷酸化蛋白突触前膜蛋白 Syntaphilin使用激酶反应联合靶向质谱的方法进行体外磷酸化单点验证，结果显示在体外 CDK5可以磷酸化突触前膜蛋白Syntaphilin，同时从侧面验证了本研究中定量磷酸化质谱的可靠性及生物信息学预测结果。
　　结论：通过构建一种经典的PD动物模型，运用iTRAQ技术来研究PD发病过程中磷酸化蛋白变化情况，绘制了PD发病过程中磷酸化水平升高的蛋白和其可能的上游激酶之间的相互作用网络，并对预测的CDK5重要底物位点进行体外激酶反应验证。为全面理解蛋白激酶通过磷酸化蛋白参与PD发病提供了基础，为解决神经系统退行性疾病提供新的靶点和思路。

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英文缩略词表

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前言

材 料 方 法

1 试剂与仪器

2.实验方法

结果

1.PD早期动物模型构建，行为学检测无明显差异

2.PD模型鼠中脑黑质区定量磷酸化蛋白质组学

3.对显著差异表达的磷酸化蛋白质进行归类分析

4.绘制基于磷酸化蛋白质组学的激酶-底物拓扑网络图

5.绘制CMGC激酶家族的网络图

6.除外CMGC家族的其他激酶构建的网络图

7. 预测到的可能的CDK5底物GO分析，并使用靶向质谱，体外激酶反应验证Snph磷酸化位点

讨论

结论

附录:

参考文献

创 新 点

综述: 蛋白激酶在帕金森病中的作用

致谢