肿瘤易感性相关的单核苷酸多态性验证及其基于纳米材料的新型检测方法研究

摘要

单核苷酸多态（single nucleotide polymorphism，SNP）是指在基因组的水平上由于单个核苷酸发生变异，并由此导致的DNA序列的多态性。SNP被认为是决定人类疾病易感性与药物反应差异的一个确定因素，可导致不同个体之间对恶性肿瘤等复杂疾病的易感性差异，因此对其检测具有重要的生物医学价值。
　　两对引物-聚合酶链反应（polymerase chain reaction with confronting two-pair primer，PCR-CTPP）技术作为一种SNPs检测的新技术，是在序列特异性聚合酶链反应技术（polymerase chain reaction with sequence specific primer，PCR-SSP）和多重PCR技术基础上建立的。PCR-CTPP技术的使用有助于临床和流行病学大样本肿瘤易感基因的筛选，同时对肿瘤发病机制的研究、致癌物暴露所引发肿瘤风险的评估有极大的帮助。
　　毛细管电泳（Capillary Electrophoresis，CE）是继高效液相色谱技术（high performance liquid chromatography，HPLC）之后在传统的平板凝胶电泳基础上发展起来的一种新型液相分离技术。CE以高强度直流电场为驱动力，DNA片段因离子表面积和分子外形的差异导致迁移率时间的不同，从而能够检测SNP。利用CE技术，可以直接检测SNP突变类型及其位置。其中，激光诱导荧光（laser induced fluorescence，LIF）方法是目前灵敏度最高、应用最广的一种CE检测方式。
　　氧化石墨烯（Graphene oxide,GO）作为石墨烯的衍生物，易溶于水，具有较好的生物相容性。氧化石墨烯具有荧光猝灭效应，基于共振能量转移的原理，通过检测“Fluorescence Off-Fluorescence On”过程，可以实现对生物大分子、无机小分子的检测。
　　基于此，通过与我校同济医学院附属协和医院密切合作，我们采用不同的方法验证基因多态性与相关肿瘤易感性之间的关联性，在此基础上尝试建立了一种基于氧化石墨烯和FITC标记的DNA探针（FITC-DNA）通过CE-LIF对特定寡核苷酸序列进行分离检测的方法，论文的完成工作如下：
　　（1）我们基于PCR-CTPP技术检测了DNA修复基因XRCC1基因SNP多态性，探讨了其与神经胶质瘤遗传易感性的关联性。其基本策略是依据XRCC1基因三个不同的SNP位点Arg194Trp（rs1799782）、Arg280His（rs25489）和Arg399Gln（rs25487）来设计两对不同的引物，经过一次PCR扩增反应之后进行常规凝胶电泳，之后分析其SNP等位基因。由于引物3‘端碱基为引发延伸的起点，具有较高的稳定性，如果有碱基错配发生，在合适的PCR条件下，扩增效率将会十分低下，而正确的配对则能够使PCR扩增顺利进行。通过病例—对照研究发现：XRCC1密码子194Trp等位基因为中国人群神经胶质瘤高危致病基因，399位Gln等位基因同样存在着致神经胶质瘤的风险。实验证实，这一方法可以用于基因多态性与肿瘤遗传易感性的研究，这一工作为研究XRCC1多态性在中国人群发生神经胶质瘤的潜在作用提供了证据，同时这种DNA修复基因与神经胶质瘤相关性的分析为深入探讨肿瘤致病的遗传与环境因素提供了重要的参考。
　　（2）利用Meta荟萃分析方法，探讨了在叶酸代谢途径中基因多态性研究最多的MTHFR C677T基因与食管癌发病之间的关系。虽然此前已有多项实验进行展开，而且研究结果也表明：MTHFR C677T基因与食管癌的发病风险之间存在一定的关联性，但是到目前为止，其结论并不完全一致。本课题利用Meta分析方法，通过定量合成原始的研究数据，其目的是将样本量加以扩大，并在此基础上进行荟萃分析，从而能够得出更为客观和更加可信的结论。通过分析比较MTHFR C677T杂合基因型（CT）、突变纯合基因型（TT）和野生纯合型（CC）在病例组及对照组的分布发现：携带CT基因型的个体（OR=1.37，95％CI=0.79-1.84）及TT基因型的个体（OR=1.72，95%CI=1.12-2.43）患食管癌的发病风险显著增加（P<0.05），这一结论也支持了MTHFR C677T基因在食管癌发病过程中起到了较为重要的作用。研究发现携带MTHFR C677T CT基因型与TT基因型的汉族人群较其他种族人群有着相对更高的患病风险；同时也验证了MTHFR C677T TT基因型较CC基因型患病风险更高。
　　（3）以上述验证的中国人群神经胶质瘤高危致病基因XRCC1 Arg194Trp的引物序列作为靶标序列，尝试建立了一种基于氧化石墨烯（GO）的毛细管电泳（CE）-激光诱导荧光LIF检测手段，利用FITC-DNA探针对该特定寡核苷酸序列进行分离检测的方法。其具体策略为利用GO吸附FITC标记的互补DNA探针后淬灭FITC的荧光，再利用FITC-DNA/GO复合物对溶液中的该特定寡核苷酸序列T1进行识别，当存在靶标序列时，其通过DNA间的碱基互补配对将FITC-DNA从氧化石墨烯上解离下来，形成FITC-DNA/T1，荧光得以恢复，通过检测“Fluorescence OFF-Fluorescence On”的过程，进而对靶标T1进行定量分析。实验结果表明，利用CE-LIF技术，可以将未反应的FITC-DNA/GO复合物和形成的FITC-DNA/T1分开，达到先分离再检测的目的，从而大大提高了检测灵敏度，该方法进一步完善后可以作为定量目标DNA的检测方法，有望为基因多态性研究提供一种新的方法。

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1 绪 论

1.1 前言

1.2 单核苷酸多态研究概况

1.3 SNP与肿瘤遗传易感性研究

1.4 SNP的检测及分析

1.5 课题思路和主要工作

2 基于两对引物-聚合酶链反应技术检测XRCC1基因多态性及

2.1 引言

2.2 实验部分

2.3 结果与讨论

2.4 本章小结

3 亚甲基四氢叶酸还原酶C677T多态性与食管癌易感性的META分析

3.1 引言

3.2 实验部分

3.3 结果与讨论

3.4 本章小结

4 基于氧化石墨烯和FITC-DNA探针分离检测特定靶标序列

4.1 引言

4.2 实验部分

4.3 结果与讨论

4.4 本章小结

5 全文总结

5.1 结论

5.2 创新

5.3 展望

致谢

参考文献

附录 攻读学位期间发表的主要论文