红豆杉细胞培养过程中褐化机理及其控制

摘要

植物细胞大规模培养生产珍贵次级代谢产物是目前最具应用前景的植物资源替代技术之一，并且该技术仍在不断扩展其应用领域，例如生产异源动物蛋白等。但是植物细胞大规模培养的产业化应用还有很多关键问题亟待解决，其中，褐化现象几乎存在于所有植物细胞培养的应用和研究中，以及植物细胞大规模培养的放大过程中，是严重妨碍植物细胞培养技术应用的关键问题之一。然而，由于植物细胞本身的特点及其培养环境的复杂性，目前，人们对其褐化机理仍然没有清楚地认识，褐化问题仍无有效的控制方法。因此，本论文以极易发生褐化、且具有应用前景的红豆杉细胞为典型实验材料，通过系统研究揭示植物细胞培养的褐化机理，并在此基础上建立针对、有效控制方法。
　　本研究主要内容包括：⑴系统研究了红豆杉细胞培养过程中的褐化特征，并证明红豆杉细胞培养褐化现象属于生理的酶促褐化反应。表现在：褐化现象发生于红豆杉细胞培养的整个放大过程之中，并且该现象是在没有加热处理的常温培养状态下发生的；当培养基中只含蔗糖成分，并且是通过过滤除菌方式添加时，褐化现象仍然发生；硫代硫酸钠可通过抑制多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活性来控制褐化现象的发生；超生声处理模拟机械损伤可诱导提高红豆杉细胞培养褐化程度。⑵证明可代谢碳源调控的酚类物质合成是引起红豆杉细胞培养酶促褐化的决定性因素。系统研究了细胞悬浮培养的环境因素（培养基成分、渗透压、流体剪切、溶氧、蔗糖浓度、碳源）和酶促褐化之间的关系。发现虽然上述因素均在一定程度上影响褐化程度，但是培养液中蔗糖成分影响最大。当培养液中无蔗糖存在时，无褐化现象发生；当提高培养液中蔗糖浓度时，细胞总酚合成能力增强，导致褐化程度升高；并且在红豆杉细胞中超表达蔗糖代谢关键酶中性/碱性蔗糖转化酶（Neutral/alkaline invertase，NINV）基因同样可通过促进酚类物质合成提高褐化程度。此外，葡萄糖和果糖作为碳源同样可通过促进总酚合成导致褐化现象的发生，而非代谢糖如甘露醇和山梨醇作为碳源却不能导致褐化现象的发生。在培养液中含有可代谢碳源的前提下，渗透压和流体剪切主要通过对细胞造成损伤，促进细胞内酚类物质和PPO释放并相互接触，从而诱发酶促褐化反应的发生；提高培养液中溶氧水平，可通过促进总酚合成导致褐化程度升高。⑶发现黄酮类物质是引起红豆杉细胞培养酶促褐化的主要酚类物质。主要证据为：通过对两种细胞系（严重褐化细胞系和非褐化细胞系）的比较分析，并且提取培养液中的褐色物质行紫外全波长扫描以及HPLC-MS/MS检测分析，证实黄酮类物质是引起酶促褐化反应的主要酚类物质，并推测杨梅素和槲皮素是参与该反应的具体黄酮类物质。赤霉素作为抑制剂可通过抑制黄酮物质的合成而阻止红豆杉细胞培养酶促褐化的发生，进一步验证了上述结论。通过研究赤霉素对红豆杉细胞转录组和黄酮代谢产物的影响，揭示了赤霉素阻止红豆杉细胞培养酶促褐化的机理。赤霉素处理虽然整体上提高了苯丙烷途径和黄酮合成途径的大部分基因的表达量，但是对苯丙烷途径的关键酶肉桂酸-4-CoA连接酶（4-coumarate-CoA ligase，4CL）基因以及黄酮醇合成关键酶黄酮醇合成酶（Flavonol synthase，FLS）基因表达起到明显的抑制作用，最终抑制了总黄酮和黄酮醇物质（杨梅素和槲皮素）的合成，从而阻止了酶促褐化的发生。⑷根据上述研究结果，概括、总结了红豆杉细胞培养酶促褐化机理，并在此基础上建立了3种可行有效的控制方法。蔗糖流加培养：通过降低细胞培养初期蔗糖浓度降低酚类物质的合成，从而降低的褐化程度。小细胞聚集体培养：小细胞聚集体可降低流体剪切对细胞的损伤而避免酶促褐化的发生，显著促进生物量的积累。赤霉素应用培养：赤霉素可通过抑制黄酮物质的积累防止酶促褐化发生，并且对生物量积累也有一定的促进作用。

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1 绪论

1.1 课题背景

1.2 植物褐化现象及其危害

1.3 植物非酶促褐化及其机理

1.4 植物酶促褐化及其机理

1.5 植物褐化控制方法研究进展

1.6 本文研究目的及主要内容

2 红豆杉细胞培养过程中褐化特征

2.1 实验方法

2.2 结果分析

2.3 本章小结

3 环境因素对红豆杉细胞培养褐化的影响及其途径

3.1 实验方法

3.2 结果分析

3.3 本章小结

4 红豆杉细胞培养褐化发生的物质基础及分子调控机理

4.1 实验方法

4.2 结果分析

4.3 本章小结

5 红豆杉细胞培养褐化控制方法

5.1 实验方法

5.2 结果分析

5.3 本章小结

6 总结与展望

6.1 全文总结

6.2 本文创新之处

6.3 展望

致谢

参考文献

附录1 攻读博士学位期间发表的文章

附录2 文中缩略词