基于两亲性聚磷酸酯-聚乳酸共聚物肿瘤靶向纳米对比剂的研究

摘要

聚磷酸酯是一类生物相容性好、可生物降解的亲水性高分子材料，直链聚磷酸酯具有柔性和亲水性好、降解时间短等特点；聚乳酸是一类生物相容性好、可生物降解的疏水性高分子材料，已作为药用辅料被FDA批准，具有刚性强、降解时间长等特点。本文通过开环聚合反应合成了新型聚磷酸酯-聚乳酸两亲性嵌段共聚物（PAEEP-PLLA），利用适宜分子量和聚磷酸酯/聚乳酸嵌段比的PAEEP-PLLA为载体材料，分别制备了载全氟戊烷的PAEEP-PLLA纳米泡和载超顺磁性纳米Fe3O4的磁性PAEEP-PLLA纳米粒，并将乳铁蛋白（Lf）作为靶向因子与纳米泡和磁性纳米粒共价偶联，将Lf偶联的纳米泡应用于肿瘤靶向超声成像，Lf偶联的磁性纳米粒应用于肿瘤靶向磁共振成像（MRI）。开展的主要研究工作如下：
　　（1）通过开环聚合反应合成了两亲性PAEEP-PLLA嵌段共聚物。主要合成路线为：用胺基保护的乙醇胺做引发剂，辛酸亚锡为催化剂，开环聚合丙交酯，得到一端是羟基，另一端是胺基封端的聚乳酸；用胺基封端的聚乳酸为引发剂，辛酸亚锡为催化剂，开环聚合2-(N-叔丁氧羰基胺基)乙氧基-2-氧-1,3,2-二氧磷杂环戊烷单体，脱掉保护基得到 PAEEP-PLLA共聚物。采用 NMR、FTIR、GPC和 DSC等方法对PAEEP-PLLA共聚物的化学结构和理化性质进行了确证和表征。
　　（2）采用复乳-溶剂挥发法制备了包载液态全氟戊烷的PAEEP-PLLA纳米泡（PAEEP-PLLA-NBs），通过琥珀酰亚胺酯和马来酰亚胺封端的聚乙二醇将Lf与纳米泡通过共价键进行偶联，得到Lf偶联的纳米泡Lf-PAEEP-PLLA-NBs。采用FTIR和凝胶电泳实验证实 Lf通过共价键偶联到纳米泡的表面，偶联 Lf的浓度是0.297 mg/mL。激光粒度仪测定Lf-PAEEP-PLLA-NBs粒径为328.4±5.1 nm，多分散系数（PDI）为0.167±0.020，zeta电位为-12.6±0.3 mV。TEM表征显示纳米泡形态呈较规整的球状和明显核壳结构。Lf-PAEEP-PLLA-NBs置于4℃冰箱中放置3个月粒径没有明显变化，证明其稳定性良好。细胞毒性实验和溶血实验证明Lf-PAEEP-PLLA-NBs具有较好的生物相容性。细胞摄取实验表明Lf-PAEEP-PLLA-NBs与脑胶质瘤C6细胞具有特异亲和性。体外超声研究表明，纳米泡在超声波辐照下液态全氟戊烷发生气化，粒径变大，具有稳定的体外超声成像能力。裸鼠皮下瘤在体超声成像研究表明，纳米泡体内稳定超声成像时间可达120 min，是市售Sonovue微泡的10倍，同时，肿瘤组织超声成像均一、清晰。
　　（3）采用高温裂解法制备了单分散性好的油胺包裹超顺磁性Fe3O4纳米粒，粒径为10.6±0.3 nm。以PAEEP-PLLA共聚物为载体材料，采用超声乳化法制备了包载Fe3O4纳米粒的磁性PAEEP-PLLA纳米粒M-PAEEP-PLLA-NPs，将Lf通过共价键偶联到磁性纳米粒表面，得到 Lf偶联的磁性纳米粒 Lf-M-PAEEP-PLLA-NPs。激光粒度仪测定Lf-M-PAEEP-PLLA-NPs粒径为318.2±0.4 nm，PDI为0.192±0.021，zeta电位为?10.6±0.4 mV。TEM表征显示Lf-M-PAEEP-PLLA-NPs形态呈较规整的球状，Fe3O4纳米粒均匀分布在 Lf-M-PAEEP-PLLA-NPs中。细胞毒性实验证明 Lf-M-PAEEP-PLLA-NPs具有较好的生物相容性。与C6细胞和ECV304细胞孵育结果表明Lf-M-PAEEP-PLLA-NPs具有良好的脑胶质瘤细胞靶向性。Lf-M-PAEEP-PLLA-NPs的磁饱和强度为74.8 emu/g Fe，具有超顺磁性。体外MR结果表明中，M-PAEEP-PLLA-NPs和 Lf-M-PAEEP-PLLA-NPs的弛豫率分别为167.17 mM-1s-1和151.03 mM-1s-1。脑胶质瘤模型大鼠在体MRI结果表明，Lf-M-PAEEP-PLLA-NPs使肿瘤组织的T2加权MR信号迅速降低，而且随着时间的延长，信号降低的范围扩大，成像时间持续48 h。大鼠脑胶质瘤组织切片普鲁士蓝染色结果显示，大鼠脑胶质瘤组织有大量蓝色颗粒（铁离子染色）存在，表明Lf-M-PAEEP-PLLA-NPs靶向富集在大鼠脑胶质瘤组织。
　　综上所述，本文以两亲性PAEEP-PLLA共聚物为载体材料，分别构建了具有脑胶质瘤靶向的超声成像和 MR成像新型纳米对比剂，并通过体外实验和荷瘤动物在体成像阐明了其增强肿瘤超声成像和MRI的效应。研究结果为开发新型肿瘤靶向医学影像学纳米对比剂提供实验依据。

目录

声明

1 绪 论

1.1 医学影像学纳米对比剂的研究进展

1.2 聚磷酸酯及其共聚物的研究进展

1.3 本文的研究目的及主要研究内容

2 聚磷酸酯-聚乳酸共聚物的合成及表征

2.1 引言

2.2 仪器与试剂

2.3 实验方法

2.4 结果与讨论

2.5 本章小结

3 偶联乳铁蛋白聚磷酸酯-聚乳酸纳米泡作为超声成像对比剂的研究

3.1 引言

3.2 仪器与试剂

3.3 实验方法

3.4 结果与讨论

3.5 本章小结

4 偶联乳铁蛋白磁性聚磷酸酯-聚乳酸纳米粒作为MRI对比剂的研究

4.1 引言

4.2 仪器与试剂

4.3 实验方法

4.4 结果与讨论

4.5 本章小结

5 全文总结

5.1 论文的主要研究结果

5.2 论文的创新之处

5.3 展望

致谢

参考文献

附录1 攻读博士学位期间完成的论文

附录2 主要缩写词表 （按字母顺序排列）