子痫前期中PD-1/PD-L1信号通路对Treg/Th17免疫平衡调控的机制研究

摘要

第一部分 PD-1、PD-L1、Foxp3和RORγt在子痫前期患者胎盘组织中表达的研究
　　目的：通过检测PD-1与其配体PD-L1，以及Treg和Th17细胞的特异性核转录因子 Foxp3和 RORγt在子痫前期患者和正常孕妇胎盘组织中的表达水平及其差异，探讨PD-1/PD-L1信号通路在子痫前期发病机制中的作用。
　　方法：以正常晚孕妇女为对照组（n=16），临床确诊为子痫前期的患者为研究对象（n=10）。收集两组孕妇的胎盘，采用免疫组化法检测胎盘中 PD-1、PD-L1、Foxp3和RORγt蛋白的表达，荧光定量PCR法和Western blot法分别检测胎盘中PD-1、PD-L1、Foxp3和RORγt mRNA和蛋白表达水平。
　　结果：1. PD-1、PD-L1、Foxp3和RORγt蛋白在子痫前期患者和正常孕妇的胎盘组织中均有表达，PD-1和PD-L1主要位于胎盘绒毛滋养细胞中，主要在细胞浆和细胞膜中表达；Foxp3和RORγt主要位于胎盘绒毛滋养细胞及绒毛间质细胞中，主要在细胞核和细胞浆中表达。
　　2.与正常妊娠组相比，子痫前期组胎盘中PD-1 mRNA表达水平明显降低（P<0.05），PD-L1 mRNA表达水平明显降低（P<0.05），Foxp3 mRNA表达水平明显降低（P<0.01），RORγt mRNA表达水平明显升高（P<0.05）。
　　3.与正常妊娠组相比，子痫前期组胎盘中PD-1蛋白表达量明显降低（P<0.01），PD-L1蛋白表达量明显降低（P<0.01），Foxp3蛋白表达量明显降低（P<0.01），RORγt蛋白表达量明显升高（P<0.01）。
　　结论：胎盘组织中PD-1和PD-L1主要表达于绒毛滋养细胞，子痫前期患者胎盘中Foxp3表达水平明显降低，RORγt表达水平明显升高，提示Treg/Th17免疫失衡可能在子痫前期中发挥作用，PD-1和PD-L1表达水平的下降可能与子痫前期的发生有关。
　　第二部分PD-L1 Fc活化PD-1/PD-L1信号通路对子痫前期样大鼠的治疗效应及分子机制研究
　　目的：采用一氧化氮合成酶抑制剂-亚硝基左旋精氨酸甲酯（L-NG-Nitroarginine Methyl Ester,L-NAME）建立子痫前期样大鼠模型，从孕鼠血压、尿蛋白、体重增长、肝肾功能、外周血及胎盘中Treg/Th17细胞平衡的改变和子代结局等方面评价PD-L1 Fc融合蛋白在治疗子痫前期样大鼠中的疗效，并进一步探讨其作用机制。
　　方法：1.将20只 SD雌鼠随机分为4组：正常妊娠组、子痫前期样组、硫酸镁（MgSO4）治疗组及PD-L1 Fc治疗组，每组5只大鼠。后三组分别给予皮下注射L-NAME建立子痫前期样大鼠模型。在妊娠第16天，分别给予前两组生理盐水，后两组分别给予MgSO4和PD-L1 Fc融合蛋白，均为皮下注射给药方式。
　　2.在大鼠妊娠前、妊娠后隔日采用无创大鼠尾动脉测压仪测量大鼠血压，收集妊娠前，妊娠第10、17、20天的24小时尿液进行尿蛋白定量分析；从妊娠第2天开始，每隔一日称量大鼠体重，至妊娠第21天。
　　3.妊娠第21天，取母鼠肝肾组织，进行HE染色及分析；取母鼠脾脏，采用流式细胞技术检测脾脏淋巴细胞中Treg和Th17细胞的数量。
　　4.免疫荧光法检测胎盘Foxp3、RORγt蛋白的表达。
　　5.荧光定量PCR及Western blot法检测PD-1/PD-L1信号通路相关分子mRNA及蛋白的表达。
　　6.计数仔鼠数量和胚胎吸收率，称量仔鼠及胎盘重量，测量仔鼠体长。
　　结果：1.正常妊娠组大鼠在整个孕期收缩压较稳定，妊娠第16天为116.0±1.581 mmHg；大鼠注射L-NAME后收缩压升高，妊娠第16天时为138.8±1.643 mmHg，明显高于正常妊娠组（P<0.001）。子痫前期样组的收缩压从妊娠第14天开始一直持续高位到妊娠结束，MgSO4治疗组和PD-L1 Fc治疗组的收缩压在治疗后下降，MgSO4的治疗效果迅速但短暂，PD-L1 Fc的治疗效果稳定且持久，降压效果可持续到妊娠第18天。
　　2.注射L-NAME后，子痫前期样大鼠的尿蛋白明显升高（P<0.001），MgSO4治疗对此无明显改善作用，经过PD-L1 Fc治疗后，大鼠在妊娠第20天时尿蛋白水平明显降低（P<0.05）。与正常妊娠组相比，子痫前期样大鼠组在妊娠期间体重增长减少（P<0.05），PD-L1 Fc治疗后体重增长有相对升高趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）。子痫前期样大鼠的肝肾病理损伤评分相比正常妊娠组均显著升高（P<0.001,P<0.001），PD-L1 Fc治疗组的肝肾病理损伤评分相比其他造模组均明显下降。
　　3.与正常妊娠组相比，子痫前期样大鼠组外周中Treg细胞比例明显下降（P<0.01），Th17细胞比例明显增加（P<0.01），Treg/Th17比例明显下降（P<0.01），PD-L1 Fc治疗后Th17细胞比例明显降低（P<0.01），Treg/Th17比例明显上升（P<0.01）。
　　4.免疫荧光结果显示 Foxp3、RORγt蛋白在胎盘上均有表达，与子痫前期样大鼠组相比，PD-L1 Fc治疗组胎盘上Foxp3mRNA表达水平升高（P<0.05），RORγt mRNA表达量降低（P<0.01），PD-1、PD-L1mRNA表达水平也分别升高（P<0.05,P<0.05）。PD-L1 Fc治疗后，PI3K/AKT/mTORmRNA表达水平下降，PTEN mRNA表达水平升高。蛋白检测结果显示上述分子的蛋白水平变化与 mRNA表达水平变化一致。
　　5.子痫前期样大鼠的仔鼠表现为：肢体畸形，体重较轻，体长较短。与正常妊娠组相比，子痫前期样大鼠的胚胎吸收率明显增加（P<0.01），PD-L1 Fc对仔鼠发育的影响主要表现为仔鼠体重和体长有增加趋势，胚胎吸收率下降，与正常妊娠组相比无明显差异，胎盘重量明显增加（P<0.05）。
　　结论：PD-L1 Fc融合蛋白可以改善L-NAME诱导的子痫前期样大鼠模型的临床症状，且治疗效果优于传统治疗药物MgSO4。PD-L1 Fc融合蛋白可以逆转大鼠外周和胎盘局部 Treg/Th17细胞免疫失衡，这种调控作用主要通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路，促进PTEN的表达实现。此外，PD-L1 Fc融合蛋白表现出对胎儿发育的保护性作用，提示其有潜在的治疗子痫前期的价值。
　　第三部分 PD-1/PD-L1信号通路对子痫前期患者外周血初始CD4+T细胞分化的影响研究
　　目的：通过激活或阻断PD-1/PD-L1信号通路，在不同干预条件下与初始CD4+T（Na?ve CD4+T）细胞共培养，以阐明PD-1/PD-L1通路对Na?ve CD4+T细胞分化为Treg和Th17细胞的影响及作用机制。
　　方法：采集正常晚孕妇女（n=15）和子痫前期患者（n=15）的外周血，采用免疫磁珠法分选出外周血中Na?ve CD4+T细胞，分别在Th0、Treg和Th17免疫环境下，单独培养或与PD-L1 Fc融合蛋白或anti-PD-L1 mAb共培养，采用荧光定量PCR方法检测PD-1/PD-L1信号通路相关分子Foxp3、RORγt、PI3K、AKT、m-TOR和PTEN mRNA的表达水平。
　　结果：1.正常妊娠组中，在Th0培养条件下，Foxp3 mRNA表达水平在加入PD-L1Fc后明显升高（P<0.05），在加入anti-PD-L1 mAb后明显降低（P<0.05）；在Th17培养条件下，Foxp3 mRNA表达水平在加入PD-L1 Fc后明显升高（P<0.001），在加入anti-PD-L1 mAb后无明显改变，相比Th17+ PD-L1Fc组表达水平明显下降（P<0.001）；在Treg培养条件下，加入PD-L1Fc或anti-PD-L1 mAb后Foxp3 mRNA表达水平均无明显改变；子痫前期组中，在 Th0培养条件下，Foxp3 mRNA表达水平在加入PD-L1Fc后明显升高（P<0.05）；在Th17培养条件下，Foxp3 mRNA表达水平在加入PD-L1Fc后明显升高（P<0.05）；在Treg培养条件下，加入PD-L1Fc或anti-PD-L1 mAb后Foxp3mRNA表达水平均无明显改变。
　　2.正常妊娠组中，在Th0培养条件下，RORγt mRNA表达水平在加入PD-L1Fc后明显降低（P<0.05），在加入anti-PD-L1 mAb后表达水平明显升高（P<0.05）；在Th17培养条件下，加入PD-L1 Fc后RORγt mRNA表达水平明显下降（P<0.05）；在Treg培养条件下，RORγt mRNA表达水平在加入anti-PD-L1 mAb后明显升高（P<0.05）；子痫前期组中，在Th0培养条件下，RORγt mRNA表达水平在加入anti-PD-L1 mAb后明显升高（P<0.001）；在Th17及Treg培养条件下，RORγt mRNA表达水平在加入PD-L1Fc后有下降趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）。
　　3.正常妊娠组中，在 Th0培养条件下，加入 PD-L1 Fc后 PI3K、AKT、m-TOR mRNA表达水平分别明显降低（P<0.05,P<0.05,P<0.05），PTENmRNA表达量升高（P<0.05），PTENmRNA表达水平在加入anti-PD-L1 mAb后明显降低（P<0.01）；在Th17培养条件下，加入PD-L1Fc后AKTmRNA表达水平显著下降（P<0.05）；在Treg培养条件下，加入anti-PD-L1 mAb后m-TOR mRNA表达水平明显升高（P<0.05）；子痫前期组中，在Th0培养条件下，加入PD-L1Fc后AKTmRNA表达水平明显降低（P<0.05），加入anti-PD-L1 mAb后PI3K、AKT、m-TOR mRNA表达水平分别明显上升（P<0.01,P<0.05,P<0.01）；在Th17培养条件下，PI3K mRNA表达水平在加入anti-PD-L1 mAb后明显升高（P<0.01）；在Treg培养条件下，加入PD-L1Fc后，PTENmRNA表达量明显升高（P<0.01）。
　　结论：在不同培养条件下，加入PD-L1Fc后Foxp3 mRNA表达水平明显升高，RORγt mRNA表达水平明显降低，加入anti-PD-L1 mAb后Foxp3 mRNA表达水平明显降低，RORγt mRNA表达水平明显升高，提示PD-L1Fc融合蛋白促进Na?veCD4+T细胞向Treg细胞分化，anti-PD-L1 mAb促进Na?veCD4+T细胞向Th17细胞分化，这两种效应分别是通过激活或抑制PD-1/PD-L1信号通路，调控信号通路相关分子PI3K、AKT、m-TOR和PTEN的表达实现。

目录

封面

声明

目录

英文缩略词表

中文摘要

英文摘要

本研究的创新点

参考文献

第一部分 子痫前期患者胎盘中PD-1、PD-L1、Foxp3及RORγt表达的研究

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 PD-L1 Fc活化PD-1/PD-L1信号通路对子痫前期样大鼠的治疗效应及分子机制研究

材料和方法

结 果

讨论

参考文献

第三部分 PD-1/PD-L1信号通路对子痫前期患者外周血初始CD4+T细胞分化的影响研究

材料和方法

结 果

讨论

参考文献

实 验 小 结

综述: PD-1/PD-L1信号通路在母胎免疫耐受及妊娠相关疾病中的研究进展

博士期间发表的论文

致谢