肿瘤抑制蛋白p53通过microRNAs调控B7-H1表达的研究

摘要

第一部分P53敲除A375细胞系的建立
　　目的：利用CRISPR/CAS9系统建立p53敲除的细胞系
　　方法：设计两条针对人的p53基因的gRNA，分别将两条 gRNA插入pBT-U6-Cas9-2A-GFP表达质粒，然后将含有不同 gRNA的质粒分别转染进入 K562细胞，用SUVEYOR突变检测试剂盒，对两条设计的gRNA的剪切效率进行比较，选取效率较高gRNA进行后续p53敲除。在A375细胞中转染GFP标记含有gRNA和CAS9核酸酶的质粒，验证突变，同时流式分选出GFP阳性的细胞。将分选出的细胞，分别单个接种于96孔板，待其克隆形成。部分克隆形成之后，将其扩增传代，形成单克隆细胞系。为从中筛选出p53敲除细胞，首先我们使用x-ray处理所有获得克隆，然后免疫电泳检测所有克隆中p53的表达情况，选出p53表达阴性的克隆进行测序，以验证p53敲除的可靠性。同时也对X射线刺激细胞，然后对p53下游基因p21进行检测，以在功能上确认p53的敲除。
　　结果：SUVEYOR结果显示设计的两条gRNA均可以造成突变，编辑效率第一条gRNA较好。使用gRNA1转染A375细胞，SUVEYOR检测到突变发生。Western检测p53在各个克隆中的表达发现，在获得的23个克隆中，有3个克隆在p53位置出现了缺失，敲除效率为3/23.同时使用PCR对敲除位点进行了扩增，相比正常WT p53条带，所获得疑似敲除克隆的p53条带位置均发生了变化。测序结果显示，所获得三个阳性克隆p53基因段均发生了明显的基因插入或者缺失，导致了p53表达的失调。最后对p53下游基因p21的表达进行检测，发现所获克隆中，在p53已被激活的情况下，p21的表达全部缺失。
　　结论：利用CRISPR/CAS9系统，成功敲除p53基因，获得了稳定遗传的p53完全敲除和p53变异细胞株。
　　第二部分 p53通过microRNAs抑制B7-H1的表达
　　目的：研究p53敲除后是否对细胞B7-H1的表达造成影响以及通过何种机制影响其表达
　　方法：分别用流式检测A375，HCT116和其p53敲除前后的B7-H1表达；使用RT-PCR检测 B7-H1的信使 RNA在 A375，HCT116和其 p53敲除细胞系中的表达；使用microRNA芯片检测A375和A375Δp53细胞之间的microRNA表达差异，并结合B7-H1靶点预测，从而筛选出可能具有对B7-H1具有调控功能的microRNAs；将筛选出来的microRNAs mimics转染A375Δp53细胞，观察B7-H1在各个不同mimics转染后的表达情况，选择出调控B7-H1表达的microRNA；使用特异性inhibitors同mimics一同转染A375Δp53细胞，以确认microRNA作用的特异性；使用qRT-PCR检测A375，HCT116和其 p53敲除前后以及使用 siRNA敲除 p53之后的microRNA-34a以及microRNA-200b表达，以验证p53对microRNA-34a以及microRNA-200b表达的调控作用，并使用免疫电泳对p53以及B7-H1的表达进行检测。构建双荧光报告载体验证microRNA-34a以及microRNA-200b靶向作用于B7-H1的3UTR。
　　结果：当p53缺失时，通过流式检测发现B7-H1的表达在A375，HCT116细胞中均明显上升；之后，对B7-H1的信使RNA表达水平进行检测，发现p53的敲除，并不影响B7-H1 mRNA的表达，结果无显著性差异；通过筛选，并结合靶向预测，我们发现在p53敲除前后，有8个候选microRNAs可能调控B7-H1表达。转染mimics后发现，microRNA-34a和microRNA-200b可下调B7-H1在A375Δp53细胞中的表达，差异明显。在加入microRNA-34a和microRNA-200b inhibitors共转染时，这种下调效果可被消除。实时定量PCR检测发现，在p53敲除或敲低的情况下，microRNA-34a和microRNA-200b表达明显下降，同时B7-H1的表达上调。双荧光素报告载体检测发现，microRNA-34a和microRNA-200b可特异性结合域B7-H1的3’UTR端调控转录。
　　结论：p53的敲除下调 microRNA-34a和 microRNA-200b的表达，从而抑制microRNA-34a和microRNA-200b对B7-H1信使RNA的作用，导致B7-H1蛋白表达上升。
　　第三部分 microRNA-34a和microRNA-200b调控Jurkat增殖和细胞因子分泌
　　目的：研究microRNA-34a和 microRNA-200b通过调控 B7-H1分子从而影响 Jurkat细胞的功能，介导免疫抑制。
　　方法：培养Jurkat细胞，用TPA刺激，诱导其表达PD-1受体，免疫电泳检测诱导表达效果；将诱导表达PD-1的Jurkat细胞同A375Δp53细胞共培养，利用B7-H1阻断性抗体抑制 B7-H1/PD-1通路的激活，观察 Jurkat细胞的增殖情况。在使用microRNA-34a和microRNA-200b的mimics和inhibitors分别转染A375Δp53细胞后同Jurkat细胞共培养，以观察microRNA-34a和microRNA-200b对细胞造成的增殖改变。同时收集共培养细胞的上清培养液，检测microRNA-34a和microRNA-200b对细胞分泌IFN-gamma，IL-2细胞因子的影响。
　　结果：jurkat细胞在 TPA刺激后，其 PD-1的表达明显增强。将刺激后的细胞同A375Δp53细胞共培养，其增殖受到明显抑制，在用B7-H1抗体阻断后，此种增值抑制效应可以得到解除；同时，结果显示，A375Δp53细胞相对于A375细胞更能明显抑制Jurkat细胞增殖。在A375Δp53细胞中转染进microRNA-34a和microRNA-200b的mimics后可以部分消除对Jurkat细胞的增殖抑制效应，加入对应inhibitors，可以恢复对Jurkat细胞的抑制。同时对细胞因子的检测发现，A375Δp53细胞表达B7-H1抑制Jurkat细胞的细胞因子分泌，microRNA-34a和microRNA-200b的mimics转染可以有效解除抑制效果，共转染对应inhibitors可以使得分泌再次被抑制。
　　结论：PD-1/B7-H1通路的激活可以抑制Jurkat细胞的增殖。A375Δp53细胞相比A375细胞具有更强的免疫抑制能力，此种抑制效应同microRNA-34a和microRNA-200b对B7-H1表达的调控具有联系。microRNA-34a和microRNA-200b的表达可以明显抑制对Jurkat细胞功能的抑制。

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第一部分 P53敲除A375细胞系的建立

引言

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结果

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第二部分 p53通过microRNAs抑制B7-H1的表达

引言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第三部分 microRNA-34a和microRNA-200b调控Jurkat增殖和细胞因子分泌

引言

方法与材料

结果

讨论

参考文献

全文总结

综述: 肿瘤抑制蛋白p53同microRNAs之间的联系

附 录：攻读博士期间发表文章

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