巨噬细胞IRAK-M分子促进结核分枝杆菌胞内存活机制的研究

摘要

目的：
　　结核分枝杆菌是胞内寄生菌，入侵宿主时，特异性感染宿主巨噬细胞，并在巨噬细胞中存活。白介素-1受体相关激酶-M（IRAK-M）属于IRAK家族成员，是Toll样受体（TLR）信号机制中的负调节分子，特异性表达于单核/巨噬细胞。本课题从巨噬细胞极化的角度，深入探讨了巨噬细胞IRAK-M分子促进结核分枝杆菌胞内存活的机制，以深入了解结核的发病机制以及宿主与结核分枝杆菌的关系。
　　方法：
　　免疫荧光染色（Immunofluorescence，IF）、Western blot和免疫组织化学技术（Immunohistochemistry，IHC）用于检测M.tb感染U937细胞和肺结核组织学标本中IRAK-M的表达。以经PMA诱导为巨噬细胞的人白血病单核细胞系U937和人急性T淋巴细胞白血病细胞Jurkat为细胞模型，分别用慢病毒（lentivirus，LV）为载体构建IRAK-M干扰和过表达体系，M.tb感染后采用抗酸染色（acid-fast staining，AF）和菌落计数（colony forming units，CFU）检测细胞内存活的细菌数目。在U937 IRAK-M干扰体系中，M.tb感染后采用Western blot技术检测M1型巨噬细胞极化标记分子pSTAT1、iNOS、NF-κB p65和M2型巨噬细胞极化标记分子pSTAT6、Arg-1、NF-κB p50的表达；用免疫激活剂CpG7909激活U937巨噬细胞首先向M1型极化，继而用M. tb感染细胞，用免疫荧光和Western blot技术检测IRAK-M在M.tb感染中对免疫激活剂诱导的M1型巨噬细胞极化状态的影响；用IHC和Western blot技术检测IRAK-M对与巨噬细胞杀菌和组织修复相关的Hif-1α、pERK1/2的影响。
　　结果：
　　在结核感染的巨噬细胞和肺组织中，IRAK-M的表达显著升高（P<0.05）；在Jurkat细胞中，IRAK-M过表达促进M. tb细胞内增殖，而在U937细胞中，干扰IRAK-M后M.tb细胞内增殖受到抑制；在U937细胞中，结核感染时，干扰IRAK-M促进巨噬细胞M1型极化标记分子pSTAT1、iNOS、NF-κB p65的表达，抑制M2型极化的标记分子pSTAT6、Arg-1、NF-κB p50的表达，提示干扰IRAK-M可以促进M. tb感染时巨噬细胞向M1型极化；2μg/ml免疫激活剂CpG7909可诱导U937细胞M1型极化，而M. tb感染抑制CpG7909诱导的M1型极化，干扰IRAK-M则逆转M.tb抑制的CpG7909诱导M1型极化；干扰IRAK-M促进与巨噬细胞杀菌和组织修复相关的Hif-1α、pERK1/2的表达增加。
　　结论：
　　巨噬细胞IRAK-M分子可能通过调控巨噬细胞极化而对胞内寄生菌结核分枝杆菌的胞内存活具有重要的生物学意义，并有可能与其他信号机制，如与宿主组织修复和杀菌有关的Hif-1和MAPK信号机制共同作用，共同对结核分枝杆菌胞内寄生和机体Th1型抗结核免疫反应产生影响。

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前言

一、结核分枝杆菌的流行病学资料和生物学特性

二、巨噬细胞

三、IRAK家族和PAMP

五、本课题的研究内容

材料与方法

一、实验材料和仪器

二、实验方法

结果

1. IRAK-M分子在结核分枝杆菌标准株H37Rv感染巨噬细胞系以及肺结核病人肺组织中表达水平升高。

2. 结核分枝杆菌标准株H37Rv感染巨噬细胞系中，IRAK-M过表达导致细胞荷菌量增多，而IRAK-M表达抑制导致细胞荷菌量减少。

3. 抑制IRAK-M表达促进M. tb感染的巨噬细胞M1型极化而抑制M2型极化。

4. CpG7909可诱导M1型巨噬细胞极化，而M. tb感染抑制CpG7909诱导的M1型巨噬细胞极化，干扰IRAK-M可逆转M. tb对CpG7909诱导的M1型巨噬细胞极化的抑制作用。

5. 在M. tb感染后，IRAK-M可以影响Hif-1和MAPK信号通路。

讨论

一、IRAK-M在结核菌感染中表达增加的生物学意义

二、IRAK-M在结核菌感染中对巨噬细胞极化的影响

三、CpG7909佐剂效应与抗结核感染分离的机制

四、IRAK-M与其他信号机制的相互作用

五、研究展望

结论

参考文献

综述: 巨噬细胞对结核分枝杆菌存活的机制研究

攻读硕士学位期间论文发表情况及获得奖励

致谢