基于代谢调控提高产气肠杆菌产氢效率及其可再生底物预处理方法研究

摘要

氢能被认为是未来最理想的能源之一。生物制氢因具有可持续、条件温和、环境友好，且可与污染物处理相偶联等优点，而越来越受到人们的重视。然而，截至目前生物制氢的研究尚未取得突破性进展，工程菌的产氢效率远未达到产业化的要求。因此，阐明生物产氢机理、提高产氢效率仍是生物制氢亟待解决的重要科学问题。
　　本研究以一株野生型产气肠杆菌(Enterbacter aerogenes) CCTCC AB91102为出发菌株，该菌为兼性厌氧菌，且分子生物学操作便利，生长速率高，在理想条件下具有最高的理论产氢效率(10mol H2/mol葡萄糖)，产氢能力提升空间大。为提高 E. aerogenes的产氢能力，并明晰其产氢机理，分别或同时敲除了吸氢酶基因和产氢竞争途径中关键酶基因，在此基础上，通过过表达 NAD合成酶，研究了细胞中 NAD水平对产氢代谢中碳流分配的影响。同时，为使得到的高效产氢工程菌能够运用到实际生产中，还对可再生废弃物的预处理方法进行了探索，以微藻水解产物为底物，高效工程菌为生产菌株，进行了厌氧批次产氢发酵实验，优化了发酵参数。主要研究内容和结果摘要如下。
　　1.敲除竞争途径关键酶基因ldh和ppc对产气肠杆菌产氢的影响。乳酸和琥珀酸是E. aerogenes CCTCC AB91102除产氢外最主要的糖酵解产物。本研究从该菌基因组DNA中克隆得到编码产乳酸途径关键酶乳酸脱氢酶(LDH)的基因ldh和产琥珀酸途径关键酶编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)的基因 ppc。利用这两个基因的PCR产物在Red重组系统的介导下与基因组中的基因进行同源重组。经PCR验证、抗性验证和代谢产物分析，表明目标基因已从基因组中完全敲除。所得到的三个突变菌株中 AB91102-L(Δldh)和 AB91102-P(Δppc)产氢效率相对野生菌分别提高了12.4％和32.2%，产氢量分别降低4.5%和6.1%，AB91102-L产乳酸途径被阻断，AB91102-P产琥珀酸降低94.6%。双基因敲除菌株AB91102-LP(Δldh，Δppc)生长缓慢，产氢量显著降低。
　　2.敲除吸氢途径关键酶小亚基基因 hybO对产气肠杆菌产氢的影响。从 E. aerogenes基因组中克隆得到hybO基因后，其PCR产物通过Red重组系统介导与野生菌、AB91102-L和 AB91102-P分别进行同源重组得到三个突变菌株 AB91102-O(ΔhybO)、AB91102-OL(ΔhybO/Δldh)和AB91102-OP(ΔhybO/Δppc)，其中突变菌株AB91102-O和AB91102-OP的产氢效率相对野生菌分别提高24.0%和68.8%，产氢量相对野生菌分别增加21.3%和27.6%。AB91102-OP产氢能力的显著增长表明，减少氢气消耗和阻断竞争代谢途径是提高产氢的有效策略，同时存在某种程度的协同效应。
　　3.过表达NAD合成酶促进产气肠杆菌及其突变菌产氢的研究。从AB91102基因组中克隆得到编码NAD合成酶的基因nadE。通过对pET-28(+)质粒进行改造，获得能够在E. aerogenes中表达外源蛋白的质粒pET28kan。构建pET28kan-nadE，转入AB91102野性型和多株突变体中，SDS-PAGE和Western-Blot实验证明NAD合成酶内源表达成功，获得两个突变菌株 AB91102-O/N(ΔhybO/nadE)、AB91102-OP/N(ΔhybO/Δppc/nadE)和一个对照菌株AB91102-OC。厌氧恒化实验结果表明，AB91102-ON和AB91102-OP/N的NADH/NAD+总浓度较对照菌分别增加了91.2%和109.7%，但NADH/NAD+比值则分别从1.11下降到0.83和0.94。AB91102-ON的产氢效率和产氢量分别增长了66.0%和165.8%，AB91102-OP/N则分别增长了149.5%和301.1%，AB91102-OP/N的最高产氢量达到了5.1L/L。通过分析代谢终产物浓度、产氢直接相关的NADH利用率(NADH)UH/Glu(该概念为本文首次提出)以及ADH、LDH和BDDH等酶活的变化，结果表明：降低氢气消耗、提高NADH的利用率和提高NAD的总浓度三种策略对促进产氢的协同效应明显。
　　4.预处理“微藻提脂残留物”(LMBRs)的方法研究。利用“脂肪酶发酵酵母残余物”(LYBRs)自溶产物中存在的蛋白酶，在48 ℃下催化处理LMBRs24 h，使LMBRs中总氮含量降低了45.0%。将处理和未处理过的样品进行热碱法水解，得出在100 ℃下处理过的LMBRs产还原糖和可溶性总氮的量均最高，分别为189.3 mg/g LBMRs和36.56 mg/g LBMRs，其中氨基酸含量为102.8 mg/g LBMRs；未用自溶产物处理过的LMBRs水解产生的还原糖仅为该产量的87.1%。说明以酵母自溶物预处理再进行热碱水解是一种简单有效的LMBRs处理方法。
　　5.优化以 LMBRs水解产物为底物产氢发酵条件。采用中心组合设计，通过三次平行实验取得的数值，拟合得到反应温度、接种量和pH值与产氢量之间关系的多元二次回归模型。方差分析(ANOVA)结果显示，该模型的显著性和可靠性较高，拟合效果良好。该模型预测出的最佳产氢结果为54.22 mL/g LMBRs，产氢条件为温度37.55 ℃，接种量12.25%，pH值5.95。进行了厌氧批次发酵产氢验证实验，实际结果为54.61 mL/g LMBRs，与预测值十分接近，说明该模型能较好反映三因素对产氢量的影响。

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主要缩写词

1 绪 论

1.1 氢能源

1.2 利用微生物制备氢气

1.3 通过代谢工程促进氢气生产

1.4 利用藻类为底物生产生物能源

1.5 本课题的研究目的和意义

2 敲除产气肠杆菌产氢竞争途径关键酶基因对产氢的影响

2.1 材料与方法

2.2 结果与分析

2.3 讨论与小结

3 过表达NAD合成酶对促进产氢的影响

3.1 材料和方法

3.2 结果与分析

3.3 讨论与小结

4 用于产氢的生物质废弃物预处理方法研究

4.1材料和方法

4.2 结果与分析

4.3 讨论与小结

5 生物质废弃物水解产物产氢条件研究

5.1 材料和方法

5.2 结果与分析

5.3 讨论与小结

6 全文总结与展望

6.1 全文总结

6.2 展望

致谢

参考文献

附录1 攻读博士研究生期间发表的学术论文目录

附录2 基因序列

附录3 各种仪器和设备