血管生长因子AGGF1通过激活自噬促进血管新生治疗缺血性心脏病

摘要

AGGF1基因是我们实验室通过基因连锁定位分析先天性静脉畸形骨肥大综合征（Klippel-Trenaunay syndrome，简称KTS）时发现并克隆出的第一个KTS基因。AGGF1基因编码一新的血管生成因子蛋白质，含有一个FHA结构域及一个G-PATCH结构域，能够促进血管生成。AGGF1蛋白在内皮细胞，平滑肌细胞及成骨细胞中高度表达，并且在各种组织的血管中，都能检测到AGGF1的较高表达量。鸡胚绒毛实验研究发现，重组的AGGF1蛋白和VEGF一样，有强烈的促血管生成能力。AGGF1裸质粒注射能显著提高后肢缺血小鼠的缺血后肢血流灌注并且抑制缺血后肢的组织坏死。
　　在世界范围内，缺血性心脏病是造成人类死亡的重要因素。现如今随着现在医疗水平的提高，冠状动脉介入以及冠脉搭桥术治疗可以拯救许多缺血性心脏病人。但是依然有12％的病人因为不合适的闭塞形式、弥漫性的冠状动脉粥样硬化、小血管闭塞或者一些其他复发病变，导致他们并不适合于冠状动脉介入及冠脉搭桥术治疗。但是直至今日，还没有一种被食品和药品管理局(FDA)认可的血管生成术治疗能应对冠状动脉粥样硬化、心肌梗死及其他的缺血类疾病。因此，寻找到一种能用于缺血性心脏病治疗的血管生长因子是十分重要的。此外，在缺血性心脏病的治疗过程中，研究人员发现急性心肌梗死患者在冠状动脉介入及冠脉搭桥术后，有大约30％的患者心脏会发生无复流现象。这些病人的住院率及死亡率会明显增加，严重影响预后。然而，目前为止还没有一种能有效抑制无复流现象发生的药物。鉴于这些关键科学问题，该博士论文研究课题拟以新血管生成因子AGGF1为靶标，探索治疗难治型缺血性心脏病与缺血再灌无复流的可能性与分子机制。
　　该论文分为两部分，将分别阐明血管生长因子AGGF1在治疗心肌梗死疾病及抑制心脏缺血再灌注后无复流现象中的重要作用。
　　第一部分是对急性心肌梗死疾病及自噬途径的研究。我们发现血管生长因子AGGF1能通过促进血管生长，作为冠状动脉疾病及心肌梗死疾病的潜在治疗手段。AGGF1基因被发现数年，能显著促进血管生成，但潜在机理还未知。本论文中，我们首次提出，AGGF1能在内皮细胞、血管平滑肌细胞及心肌细胞中激活自噬这种进化上保守的细胞分解代谢进程。研究发现，使用自噬途径的抑制剂Bafilomycin A1和Chloroquine，以及自噬途径激活所必须的基因Atg5的特异性siRNA抑制自噬，能抑制AGGF1诱导内皮细胞增殖、迁移、毛细血管管腔形成及基于血管环的血管生成。这说明自噬的激活在AGGF1促进血管生成中是必须的。Aggf1+/-敲除小鼠中自噬受到抑制，并且伴随着急性心肌梗死手术后血管生成受到抑制，增大的心肌梗死面积及损坏的心脏收缩功能。使用AGGF1蛋白进行治疗能显著促进心脏中血管生成，从而恢复心肌梗死小鼠的心功能及心脏收缩能力、增加小鼠生存率、减少心肌梗死面积、抑制心肌细胞的凋亡、抑制心脏纤维化等。在小鼠中用Bafilomyin A1药物抑制自噬或者使用自噬的特异性敲除小鼠Becn1+/-及Atg5敲除小鼠能显著限制AGGF1诱导血管生成的能力及治疗效果。这些结果说明，自噬的激活在血管生成的上游，是体内血管生成所必须的。我们进一步研究发现，AGGF1激活自噬途径是通过对JNK的激活，导致Vps34脂质激酶的活化并且使得Becn1-Vps34-Atg14复合体形成，最终导致自噬的激活。这些数据都说明：（1）自噬激活是冠状动脉粥样硬化疾病及心肌梗死疾病进行血管生成治疗所必须的。（2）AGGF1是诱导自噬激活的关键因子。（3）AGGF1能作为一种新的治疗手段对冠状动脉粥样硬化疾病及心肌梗死疾病进行治疗。我们的数据也说明维持或者增加自噬的激活，在进行血管生成治疗时，能增加其治疗效果。这将为血管生成治疗提供新的策略。
　　第二部分是对心脏缺血再灌注损伤后，所产生的无复流现象的研究。我们在对Aggf1+/-敲除小鼠的研究中发现，Aggf1基因在血管生长及血管完整性维持中扮演着重要的角色。Aggf1敲除小鼠表现出很严重的表型缺陷，成年的Aggf1+/-小鼠表现出高频率的组织内出血，并且血管渗漏增加。这个现象是由于Aggf1+/-小鼠血管中VE-cadherin蛋白的磷酸化水平增加，导致血管完整性受到破坏。在小鼠及内皮细胞的研究中，我们发现AGGF1蛋白能抑制VE-cadherin的磷酸化并且增加VE-cadherin的细胞膜定位。基于前面的研究结果，我们使用AGGF1对心脏缺血再灌注进行干预治疗。结果显示，AGGF1蛋白能显著抑制心脏缺血再灌注损伤导致的血管渗漏，提高心功能，减少心脏梗死面积，抑制心脏纤维化及心肌细胞坏死。
　　本学位论文的研究表明，AGGF1蛋白能通过诱导自噬促进心脏中血管新生，对缺血性心脏病产生治疗效果。同时，AGGF1蛋白还能够通过维持心脏中微血管的完整性、抑制血管渗漏，防止心脏缺血再灌注损伤导致的无复流现象发生。

目录

声明

第一部分 血管生长因子AGGF1通过激活自噬途径对急性心肌梗死进行治疗的研究

1 引言

1.1 心肌梗死

1.2 血管生成治疗

1.3 自噬

1.4 研究意义

2 材料与方法

2.1 细胞系与细胞培养

2.2 细胞转染

2.3 抗体

2.4 Western blot

2.5 蛋白质纯化

2.6 小鼠心肌梗死模型

2.7 超声心动图检测

2.8 免疫组化分析

2.9 心肌凋亡检测

2.10 HUVECs细胞的凋亡与增值

2.11 细胞迁移实验

2.12 内皮细胞管腔形成实验

2.13 体外小鼠动脉血管环实验

2.14 Vps34 第三类PI3激酶活性检测

2.15 其他自噬检测

2.16 实时定量PCR

2.17 数据分析

3 结果

3.1 AGGF1是一种通用的自噬激活调控基因

3.2 在小鼠心脏中Aggf1基因剂量不足抑制自噬

3.3 AGGF1诱导自噬的激活对血管生成是必须的

3.4 急性心肌梗死导致AGGF1表达升高

3.5 低氧诱导内皮细胞中AGGF1的表达升高

3.6 在缺氧条件下，AGGF1诱导自噬的发生

3.7 AGGF1蛋白治疗降低了心梗后小鼠的死亡率，并且显著提高了心功能

3.8 AGGF1能诱导心梗小鼠心脏中的自噬的发生

3.9 AGGF1促进心肌梗死小鼠心脏中血管生成

3.10 AGGF1蛋白治疗能抑制心梗诱导的细胞凋亡

3.11 心肌梗死后，AGGF1 单倍剂量不足抑制自噬，降低生存率并且损坏心功能

3.12 心肌梗死后，自噬途径激活是 AGGF1 调节血管生成和心脏修复所必须的：一种自噬抑制剂研究

3.13 心肌梗死后，自噬途径激活是 AGGF1 调节血管生成和心脏修复所必须的：一种自噬缺失小鼠Becn1+/-研究

3.14 心肌梗死后，自噬途径激活是 AGGF1 调节血管生成和心脏修复所必须的：一种自噬缺失小鼠Atg5flox/flox的研究

3.15 AGGF1调节自噬的分子机制

4 讨论

第二部分 AGGF1蛋白通过维持血管的完整性抑制心脏缺血后再灌注损伤及血管无复流情况发生

1 引言

1.1 血管完整性

1.2 心脏缺血再灌注损伤

1.3 各种生长因子和血管完整性

1.4 意义

2 材料与方法

2.1 微血管内皮细胞分离及培养

2.2 体外纯化AGGF1蛋白

2.3 血管渗漏实验

2.4 动物及操作

2.5 组织化学分析

2.6 实时定量PCR分析

2.7 Western blot分析

2.8 数据统计

3 结果

3.1 Aggf1+/-敲除小鼠组织中血管密度减少，出血增加并且血管渗漏增强

3.2 AGGF1调节血管渗漏的分子机制

3.3 AGGF1 蛋白抑制心脏缺血再灌注手术后 VE-cadherin 的激活和血管渗漏并且显著提高了心功能

4 讨论

致谢

参考文献

附录1 攻读学位期间发表论文目录

附录2 本文中所用的英文缩略语对照表