GSK-3β在D-半乳糖诱导的拟老化大鼠听皮层中的表达及作用

摘要

目的：初步探讨糖原合成酶激酶3β（Glycogen Synthase kinase-3β, GSK-3β）在D-半乳糖（D-galactose, D-gal）诱导的拟老化大鼠听皮层中的表达及作用，为探究老年性聋的发病机制和干预措施提供新的方向。
　　方法：选取健康的2月龄的雄性Sprague Dawley（SD）大鼠126只，随机分为对照组（NS组）和拟老化组（D-gal组）：D-gal组大鼠每日于颈背部皮下注射 D-半乳糖，剂量为500mg/kg体重，持续8周；对照组大鼠每日于相同部位注射每公斤体重等体积的生理盐水，持续8周。造模结束后，将各组大鼠随机分为3个亚组，即4月龄组（造模完成后立即处死）、10月龄组（造模完成后6个月处死）和16月龄组（造模完成后12个月处死）。用听性脑干反应（Auditory Brainstem Response, ABR）检测各组大鼠在短声刺激和多频率纯音刺激下的听域；WST-1法检测各组大鼠血清和听皮层中超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, SOD）的活力；逆转录PCR（RT-PCR）检测听皮层线粒体DNA（Mitochondrial DNA, mtDNA）常见缺失（Commen Deletion, CD）；实时荧光定量PCR（q-PCR）GSK-3β以及亲环蛋白F（Cyclophilin F, Cyp F）的mRNA表达水平；Western Blot检测GSK-3β和Cyp F蛋白表达水平；免疫沉淀检测GSK-3β和Cyp F结合的变化；免疫组化检测细胞色素c（cytochrome c）在听皮层的表达；末端原位标记法(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase(TdT)-mediated Deoxyuridine Triphosphste(dUTP) Nick-End-Labelling, TUNEL）检测听皮层神经细胞凋亡水平。
　　结果：ABR结果显示，在各频率纯音声刺激下，D-gal组和对照组大鼠的听阈没有显著变化；SOD检测结果显示， D-gal组血清和听皮层组织的SOD活力与对照组相比均显著增高；RT-PCR结果显示，与对照组相比，D-gal组大鼠听皮层的 GSK-3β和Cyp F mRNA表达水平均未见改变，仅在D-gal组中检测到16月龄大鼠相对4月龄时mRNA水平的升高有统计学差异；Western Blot结果显示，D-gal组大鼠的听皮层中GSK-3β的活性相比对照组明显升高，且其活性随着月龄的增加而升高，而 GSK-3β和Cyp F的蛋白表达在同月龄大鼠中未见显著性差异；免疫沉淀结果显示，与对照组相比，GSK-3β与Cyp F的结合在D-gal组显著增加，且其结合随着月龄的增加而增加。免疫组化结果显示，同月龄时D-gal组相比对照组的cytochrome c表达显著增加，且随着月龄的增加其表达升高。TUNEL检测结果显示，D-gal组的凋亡细胞数目相比对照组明显增加，且在随着月龄的增加，凋亡细胞也呈增多趋势。
　　结论：在拟老化大鼠的听皮层组织中，GSK-3β的活性显著增加，且GSK-3β与Cyp F的结合增加，这可能使得 Cyp F过度磷酸化，从而降低线粒体通透性转换孔（mitochondrial Permeability Transition Pore, mPTP）的开放阈值，进而引起活性氧簇（reactive oxygen species, ROS）的爆发性释放和氧化应激累积，最终导致听皮层神经细胞的凋亡增加。这些变化可能参与老年性聋的发病过程。

目录

声明

英文缩略词表

前言

材料与方法

1.主要实验仪器与试剂

2．实验动物模型的建立

3.听性脑干反应（ABR）

4．听皮层基因组DNA的提取和mtDNA CD检测

5.WST法测定大鼠血清和听皮层中SOD活力

6.大鼠听皮层RNA的提取及GSK-3β和Cyp F mRNA表达水平的检测

7.Western Blot检测听皮层中GSK-3β和Cyp F蛋白表达水平

8.免疫沉淀检测GSK-3β和Cyp F的结合

9.听皮层组织切片和免疫组织化学染色

10.统计学分析

结果

1、ABR阈值

2、mtDNA CD在拟老化大鼠听皮层的变化

3、SOD活力在拟老化大鼠血清和听皮层组织的变化

4．GSK-3β和Cyp F mRNA水平的表达变化

5．Western Blot检测听皮层中GSK-3β活性的变化

6.Western Blot检测听皮层中GSK-3β和Cyp F的蛋白表达水平

7.免疫沉淀检测GSK-3β与Cyp F的相互作用的变化

8.免疫组化检测cytochrome c蛋白表达变化

9.TUNEL染色检测凋亡水平的变化

讨论

参考文献

综述:糖原合成酶激酶GSK-3β及其对衰老的调控

致谢