Netrin-1促进脂肪源干细胞血管形成功能的研究

摘要

第一部分脂肪源干细胞的分离、培养和鉴定
　　研究目的：分离人脂肪源干细胞并对其细胞形态、免疫表型及多向分化能力观察和鉴定。
　　研究方法：
　　1.收集整形外科抽脂术后舎弃的脂肪组织，用0.1%I型胶原酶分离、过滤、离心得到人脂肪源干细胞并行原代孵育。观察细胞的形态特征。
　　2.通过流式技术检测人脂肪源干细胞的细胞外膜抗原：CD29, CD44, CD73, CD90, CD105, CD117, CD166, CD31, CD34, CD45, CD106的表达水平。
　　3.运用多种专用培养基诱导刺激人脂肪源干细胞定向分化，并相应利用其对应的染液对其多向分化潜能鉴定。
　　研究结果：
　　1.有效提取了人脂肪源干细胞，获得了大量呈长梭形旋涡状排列的贴壁细胞，外形似成纤维样细胞。
　　2.流式细胞术结果显示：CD29, CD44, CD73, CD90, CD105, CD117, CD166呈高表达（>95%），CD31, CD34, CD45, CD106呈低表达(<5%)。
　　3.脂肪源干细胞成脂肪诱导分化，油红O染色后可见细胞内有较多橘红色脂肪滴；成骨诱导分化，茜素红染色后表现为典型的红色钙化结节；成软骨诱导分化，阿利新蓝染色后表现为蓝色小体。
　　实验结论：
　　高效的提纯了人脂肪源干细胞。并证实了其多向分化能力。
　　第二部分 Netrin-1对脂肪源干细胞生物学功能的影响
　　研究目的：探讨Netrin-1对脂肪源干细胞的增殖、迁移、侵袭和血管形成等生物学功能表现的影响及其相关的分子机制。
　　研究方法：
　　1.细胞转染：利用Lipo2000将过表达Netrin-1质粒转染入脂肪源干细胞，荧光显微镜下观察转染效率，实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和免疫印迹法分别检测脂肪源干细胞在Netrin-1过表达后mRNA和蛋白水平的表达情况。
　　2.细胞的增殖功能通过CCK-8来进行检测。
　　3.细胞的迁移和侵袭功能采用Transwell模型进行研究，再利用qRT-PCR技术检测基质金属蛋白酶-2（MMP-2）和MMP-9的mRNA表达情况。
　　4.小管形成功能通过采用脂肪源干细胞与HUVEC直接或间接共同孵育模型，分析小管分支形成的长度、复杂性和成熟度来衡量过表达Netrin-1的脂肪源干细胞其促进新生血管形成的能力。同时，还从mRNA和蛋白分子水平分析血管内皮生长因子和胎盘生长因子的表达情况。
　　研究结果：
　　1.脂肪源干细胞转染过表达Netrin-1质粒后，显微镜在激发光的刺激下可见脂肪源干细胞的胞内显示大量的绿色荧光信号，并且脂肪源干细胞的Netrin-1基因在mRNA（5.03±1.99）和蛋白（3.04±0.07）水平的表达均明显提高（P<0.05）。
　　2.脂肪源干细胞过表达Netrin-1能提高细胞的增殖能力。过表达Netrin-1组的细胞增殖能力从第二天（1.39±0.06 vs1.13±0.02），第三天（2.07±0.09 vs1.34±0.50），第四天（2.67±0.06 vs1.39±0.07）起呈逐渐递增趋势（P<0.05）。
　　3.脂肪源干细胞过表达Netrin-1增强了细胞的迁移（121.3±3.22 vs51.67±1.53）和侵袭（76±1.73 vs20±2）能力，同时MMP-2（1.317±0.10）和MMP-9（3.53±0.87）的mRNA表达水平也明显提高（P<0.05）。
　　4.在小管形成实验中，单独脂肪源干细胞培养组（18.33±1.53 vs6.0±2.0）和脂肪源干细胞与人脐静脉内皮细胞共同孵育组（31.33±4.16 vs16.0±3.0），Netrin-1均明显增加了小管形成的数量、分支的长度及复杂性（P<0.05）。同时，脂肪源干细胞过表达Netrin-1的血管内皮生长因子mRNA（3.6±0.39）及蛋白（3.54±0.10）水平都明显提高了。其胎盘生长因子的mRNA（3.1±0.50）和蛋白（2.36±0.03）水平也都表达显著增强。
　　研究结论：Netrin-1过表达脂肪源干细胞能够提高细胞的增殖、迁移、侵袭和血管形成等生物学功能。

目录

声明

前言

参考文献

第一部分 人脂肪源干细胞的分离、培养与鉴定

绪言

材料与方法

实验结果

讨论

参考文献

第二部分 Netrin-1过表达对脂肪源干细胞生物学功能的影响

绪言

材料和方法

实验结果

讨论

参考文献

综述:脂肪源干细胞在血管新生中的作用

附录一：发表文章

附录二：中英文缩略词对照表

致谢