家蚕血淋巴中氨基代谢物的定量分析研究

摘要

生物体中含有种类繁多的氨基代谢物，包括生物胺、氨基酸、氨基酸衍生物、儿茶酚胺和芳香胺等。这些氨基代谢物在生物体的生命活动过程中都发挥着重要作用，其含量变化能够在一定程度上反映机体的不同生理病理状态，因此检测分析氨基代谢物对相关疾病的诊断和生理病理的研究具有重要意义。靶标代谢组学是对已知代谢物进行定性定量分析，具有从已知代谢物中直接提取生物信息的优势。以液相色谱质谱为基础的靶标代谢组学，可以通过选择合适的分离方法、离子化方法和质量分析器来达到对不同代谢物进行定性定量分析的目的。
　　本文采用新的柱前衍生化试剂5-氨基异喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯（5-aminoisoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate，5-AIQC）应用UHPLC-MS/MS对含氨基的代谢物进行分析。本方法通过加入点击反应试剂N-乙基马来酰亚胺和抗氧化试剂，可以同时定量含巯基和二硫键的氨基代谢物、易氧化的氨基代谢物以及其他氨基代谢物。方法还可以检测已报道的衍生化试剂（6-aminoquinolyl-N- hydroxysuccinimidyl carbamate，6-AQC）不能衍生的芳香胺，而且5-AIQC衍生化方法具有更高的灵敏度。该方法检测的124种分析物包括4种氨基糖、20种蛋白氨基酸、57种非蛋白氨基酸、17种修饰氨基酸、26种脂肪胺、8种芳香胺、22种含硫物质、14种神经递质和8种小肽。其中大多数具有相同质荷比（m/z）的同分异构体分析物在反相色谱柱上均可得到分离，且在质谱中均可进行定量分析。该方法定量分析的氨基代谢物涵盖了超过20多种代谢通路，如蛋白质合成/降解、精氨酸的合成、谷胱甘肽和神经递质的合成、尿素循环、尿苷分解和多胺通路等。在对混合标准品、人肾癌组织提取物、大鼠尿液和血清样品中的氨基代谢物进行分析时，本方法中大部分分析物包括含巯基和二硫键的氨基代谢物以及易氧化的胺类物质，具有很好的精密度、准确度、线性关系和回收率。运用该方法对不同生长发育时期家蚕血淋巴中的氨基代谢物进行检测，共检测出45种氨基代谢物，包括常见的20种蛋白氨基酸、11种非蛋白氨基酸、6种含硫代谢物、2种多胺、2种儿茶酚胺和2种乙醇胺，其中文献较少报道有谷胱甘肽、羟基脯氨酸、1-甲基组氨酸、3-甲基组氨酸、2-氨基己二酸、γ-氨基丁酸、2-氨基丁酸、3-氨基异丁酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸砜、腐胺、1,3二氨基丙烷、多巴胺和多巴。在家蚕不同生长发育时期，这些氨基代谢物的浓度变化较大，且不同氨基代谢物的浓度水平也具有较大差异。常见的蛋白氨基酸浓度普遍较高，能达到1mM以上。家蚕在生长发育过程中对不同氨基代谢物的需求不同，因此其机体含量也不相同。绝大多数氨基酸在眠期浓度增加，眠后浓度减少，预蛹期浓度普遍增加。通过比较不同品种家蚕在生长发育的不同时期各氨基代谢物浓度的变化，我们发现：原种蚕（A）与杂交蚕（B和C）在不同时期多数代谢物浓度在同一水平；与家蚕主要生理活动（如色素合成、丝蛋白合成、脯氨酸能量代谢等）相关的氨基代谢物浓度差异较大。三组家蚕在预蛹期都产生大量的蛋氨酸亚砜，其浓度比之前生长发育时期高出2个数量级，可能是由蛋白质的甲硫氨酸残基氧化后降解产生。
　　5-AIQC柱前衍生化氨基代谢物的定量方法能够有效的应用于生物样品的测试中。本方法一次进样可以同时定量测定大量的氨基代谢物，具有潜在的应用于临床化学的价值。

目录

声明

1 绪 论

1.1代谢组学简介

1.2液相色谱-质谱基础的代谢组学

1.3液相色谱-质谱联用技术基本原理[30,44,86]

1.4 LC-MS基础的靶标代谢组学的应用

1.5氨基代谢物概述及其检测方法

1.6家蚕概述

1.7本论文研究内容及意义

2 建立氨基代谢物的柱前衍生UHPLC-MS/MS定量分析方法

2.1实验仪器与试剂

2.2结果与讨论

2.3小结

3 UHPLC-MS/MS方法定量分析家蚕血淋巴中氨基代谢物

3.1实验材料与方法

3.2结果与讨论

3.3小结

4 总结与展望

4.1总结

4.2展望

参考文献

致谢

附录1

附录2

附录3

附录攻读学位期间发表论文目录