获取特定神经环路分子表型的快速全脑光学成像系统研究

摘要

研究已表明，脑疾病表现为外在的脑功能异常，其实质是由内在的特定神经环路异常造成的。神经环路是由不同神经元有机组合形成的、实现特定信息传递与处理的结构功能单位。分子表型包含了神经元内生物分子的表达水平、空间分布等信息，是决定神经元类型的重要生物学指征。获取特定神经环路的分子表型信息对于理解脑功能、揭示脑疾病至关重要。然而采用传统组织学方法来获取全脑范围内特定神经环路分子表型的效率低下，近年来发展的全脑显微光学成像方法未能提供分子表型信息或存在分辨率低、样本制备流程复杂等局限性。因此，如何实现高效、准确地同时获取全脑三维解剖结构与分子表型数据集，是亟待解决的技术挑战。 针对这一应用需求，本文提出了一种快速获取神经环路中神经元分子表型的方法：采用对样本形态和抗原特性无破坏的琼脂糖包埋，利用基于振动切片和结构光层析成像的快速全脑成像系统获取特定神经环路的结构投射信息，并自动保存所有样本切片，浏览全脑成像结果后即可选择目标脑区切片进行免疫组化染色。该方法的样本制备流程简单，通过快速全脑成像筛选出目标脑区并对收集的切片进行免疫染色，实现了高效地获取特定神经环路的分子表型信息。 根据该技术路线，本文研制了一套可实现自动化切片收集的快速全脑光学成像系统，重点研究了如何实现高精度振动切片、快速全脑光学成像以及自动化的切片收集。为了实现稳定、高精度的振动切片，本文设计了基于弹簧钢片振动结构和电磁力驱动的振动切片装置，实现了无机械磨损、长时间稳定运行的振动切片，并通过刀片精密调节架和Z向误差检测模块有效地将刀片振动过程中的Z向误差控制在2.5μm以内。利用该装置配合优化后的琼脂糖包埋流程，实现了对小鼠全脑高精度的切片，并将鼠脑断面的平整度控制在10μm以内。为了快速获取小鼠全脑的神经环路结构信息，本文采用结构光照明显微镜对样本浅层进行高通量宽场层析成像，配合振动切片对样本已成像部分进行切削，实现了高分辨率的快速全脑成像。最后，本文设计了适用于振动切片的流体式切片收集装置，通过控制水路中的水流来收集样本切片，达到了极高的收集率并保持了切片的形态完整性。将切片收集装置、振动切片装置和结构光照明显微镜相集成，实现了全脑快速成像过程中的自动化切片收集。 应用快速全脑光学成像系统，可在11.0个小时内完成对小鼠脑样本的Z向间隔50μm采样成像，体素尺寸为0.32μm×0.32μm×5.8μm，并顺序收集97.4%的完整样本切片。利用该系统，本文获取了小鼠脑初级运动皮层、初级躯体感觉皮层和初级视皮层的上一级输入神经元在全脑范围内的定量分布，并进一步地选取了部分输入脑区进行免疫组化染色，定量统计比较了其中输入神经元的分子表型。证明了快速全脑光学成像系统能够加快神经环路结构和分子表型信息的获取，有望为脑疾病相关的神经环路结构与功能研究提供常规技术平台。

目录

第一个书签之前