基于红细胞氧-还辅酶的整合评价膳食多酚健康效益的新方法

摘要

富含膳食多酚的食物对改善心血管疾病、糖尿病、肿瘤、衰老等多种慢性疾病有很好的预防及辅助治疗的效果，但由于膳食多酚复杂的存在体系以及体内靶点不明的特点，对于膳食多酚健康效益及作用机制的研究和评价方法体系的建立来说，是一个巨大的挑战。本文旨在开发一种精确快速的评价方式，来量化评价膳食多酚的健康效益，主要通过UPLC-MS/MS检测手段，精准分析氧化应激状态下的体外红细胞中氧-还辅酶的浓度和比例，提出整合尼克酰胺二核苷酸比例法概念（简称IPDR），IPDR与NAD+/NADH比值呈正相关、与NADP+/NADPH比值呈负相关，以此为数学模型推算IPDR值，实现多酚健康效益的定量评价。该方法有望进一步应用到对药食两用植物进行健康效益评价及有效成分筛选，为功能食品的开发提供了新的研究思路和评价方法。主要的研究工作如下： 1．利用UPLC-MS/MS的技术建立了快速精确的检测细胞内尼克酰胺氧-还辅酶的定量方法。该方法采用多反应监测（MRM）模式，对NAD+，NADH，NADP+，NADPH的检测灵敏度达到了50-100fmol级别，分析每个样品只需要5min，可以实现两对辅酶同时快速检测。并且该检测方法的RSD小于5%，回收率为87%-95%，检测方法的线性范围5-25000nM。 2．探究了体外兔红细胞过氧化氢及高糖添加诱导的氧化应激模型中红细胞溶血、脂质过氧化等指标，发现红细胞溶血和脂质过氧化与过氧化氢及葡萄糖处理浓度和处理时间呈正相关，最后确定了过氧化氢处理浓度为250μM、处理时间2h和葡萄糖添加浓度为150mM、处理时间24h、48h、72h作为体外红细胞氧化应激细胞模型。 3．选择上述两种红细胞氧化应激模型，添加8种典型多酚（槲皮素QU、槲皮苷QI、金丝桃苷HY、表儿茶素ECE、芦丁RU、儿茶素CE、矢车菊素CY、矢车菊素苷CYG）对损伤模型进行保护，检测红细胞溶血、脂质过氧化、及辅酶浓度等指标，推算IPDR值并验证该指标与多酚对红细胞的综合保护作用的相互关系。结果表明8种膳食多酚在两种氧化应激细胞模型中对溶血及脂质过氧化均有明显的保护作用，但多酚分子结构与溶血保护作用之间没有明显的规律。过氧化氢模型引起细胞的IPDR值大幅上升，说明急性氧化应激模型不适合健康效益评价，而在高糖模型中的IPDR值与脂质过氧化保护的变化趋势相似，顺序由大到小依次是QI、QU、HY、ECE、RU、CE、CY、CYG，说明高糖模型更能模拟体内氧化应激的状态，利用高糖添加下IPDR值可以更合理的反映这些膳食多酚的健康效益，因而确定了IPDR值评价多酚健康效益的主要实验条件为：150mM高糖添到体外培养的兔红细胞，体外无菌孵育24h-48h。 4．探讨了IPDR法的机理。通过膳食多酚与红细胞膜的亲和力佐证多酚综合抗氧化的健康效益。利用改量的福林酚法，分析了上述8种膳食多酚与红细胞膜结合率。结果发现，相同浓度下膳食多酚的结合力由高到低排列顺序为：QI、QU、HY、CY、ECE、CE、RU、CYG，该顺序和用IPDR模型对膳食多酚保护作用的评价表现一致，进一步说明了本研究建立的膳食多酚健康效益评价模型的科学性和合理性。

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摘 要

Abstract

目 录

1. 绪 论

1.1 膳食多酚类天然产物概述

1.1.1 膳食多酚的简介

1.1.2 常见膳食多酚结构、性质及分布

1.2 膳食多酚的健康效益及其研究现状

1.2.1 抗氧化和自由基清除

1.2.2 抑菌消炎抗病毒

1.2.3 抗肿瘤

1.2.4 抗心脑血管疾病

1.2.5 抗辐射

1.2.6 膳食多酚的其他功能

1.2.7 膳食多酚健康效益的研究现状

1.3 红细胞作为天然抗氧化剂活性评价的应用优势及研究现状

1.4 尼克酰胺辅酶与细胞代谢的关系及其精准测定方式的概述

1.4.1 尼克酰胺氧-还辅酶与细胞代谢及內源氧-还稳态的关系

1.4.1.1 NAD+、NADH、NADP+、NADPH在细胞代谢中的地位

1.4.1.2 尼克酰胺辅酶在细胞中的含量

1.4.2 尼克酰胺氧-还辅酶的精准分析方法概述

1.5 本研究膳食多酚健康效益量化评价模型的提出

1.6 研究目的意义及主要内容

1.6.1 本研究的目的意义

1.6.2 主要研究内容

2 构建UPLC-MS检测尼克酰胺氧-还辅酶的分析方法

2.1 实验材料

2.1.1.1 实验仪器

2.1.1.2 实验试剂

2.2 实验方法

2.2.1 试剂配制

2.2.2 辅酶试剂盒检测

2.2.2 方法稳定性实验

2.2.3 方法精密度实验

2.3结果与分析

2.3.2 两对辅酶HPLC检测

2.3.3 两对辅酶UPLC-MS/MS条件的确定

2.3.3.3 两对辅酶质谱条件的确定

2.3.3 两对辅酶混标进行质谱检测

2.3.4 两对辅酶的标准曲线及方法学验证

2.4 本章小结

3 红细胞氧化应激模型构建及优化

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.2.1 兔红细胞悬液的制备

3.2.2 红细胞过氧化氢氧化损伤模型优化

3.2.2.1 血红蛋白测定条件的选择

3.2.2.2 溶血率的测定实验

3.2.2.3 脂质过氧化测定实验

3.2.2.4 MDA标准曲线绘制

3.2.2.5 过氧化氢造模条件探究

3.2.2.6 高糖造模条件探究

3.3 结果与分析

3.3.1 过氧化氢造模条件优化

3.3.2 高糖造模条件优化

3.4 本章小结

4 膳食多酚对氧化损伤红细胞的保护作用

4.1 实验材料

4.2 实验操作

4.2.2 膳食多酚对于过氧化氢氧化损伤模型的保护作用

4.2.3 膳食多酚对于高糖氧化损伤模型的保护作用

4.2.4红细胞中两对辅酶的提取制样

4.2.5 利用UPLC-MS/MS测定红细胞中的尼克酰胺氧-还辅酶含量

4.3 结果与分析

4.3.1 膳食多酚保护浓度的确定

4.3.2 膳食多酚对过氧化氢处理的红细胞的保护

4.3.3 膳食多酚对高糖处理的红细胞的保护作用

4.3.4 葡萄糖处理红细胞样品中两对辅酶的含量结果

4.3.5 过氧化氢处理红细胞样品中两对辅酶的含量结果

4.3.6 整合两对辅酶带入IPDR进行验证评价

4.3.6.1 葡萄糖处理红细胞样品中两对辅酶的氧-还比例

4.3.6.2 过氧化氢处理模型两对辅酶的比例

4.3.6.3 膳食多酚健康效益数学模型的验证

4.4 本章小结

5 多酚与红细胞结合

5.1 实验材料

5.2 实验操作

5.2.2 多酚单体和红细胞结合实验

5.3 结果与分析

5.3.1 没食子酸标准曲线

5.3.2 多酚单体与红细胞的结合率

5.4 本章小结

6 总结与展望

6.1 全文总结

6.2 主要创新点

6.3 展望

参考文献

附录 攻读硕士学位期间完成的文章情况