弱光探测器的超分辨定位成像性能直接比较研究

摘要

超分辨荧光成像是本世纪显微光学成像领域最重大技术的突破之一，它为生物医学研究的诸多领域带来了新的机会。超分辨定位成像是代表性的超分辨荧光成像技术，其技术关键是将原本空间上密集排布的荧光分子随机分离到数千甚至数万幅单分子荧光图像中，然后通过单分子定位和重建技术得到一幅超分辨图像。其中，单分子定位的质量不仅和所使用的单分子定位算法有关，还决定于单分子荧光图像的质量。在超分辨定位成像系统的搭建中，选择一个合适的弱光探测器是保证单分子荧光图像质量的关键因素。本论文通过实验，系统定量的对不同弱光探测器的超分辨定位成像的性能进行评估，为超分辨定位成像领域研究人员在弱光探测器的选择和优化使用方面提供实验依据。 （1）超分辨定位成像中的原始图像质量控制：我们从两个方面来对超分辨定位成像中的原始图像质量进行控制。在实验样品方面，我们通过系列实验得到细胞和组织样品的最优化预处理流程，并选择使用纳米抗体和荧光染料Alexa Flour647相结合的改进型免疫荧光标记方法；在光学系统方面，我们对系统的关键实验参数进行测量和控制，提高对比实验的同步性和稳定性，最大程度提升弱光探测器的直接对比数据质量。我们能同时进行单分子成像，让分光比几乎达到1∶1，成像时的x、y轴的漂移在±10nm以内。。 （2）基于荧光小球的探测器成像性能直接比较：利用第二章讨论的能用于直接比较探测器成像性能的光学系统以及经典的模型实验样品——荧光微球，并且考虑了不同定位算法对成像结果的影响，我们直接比较了三个代表性的弱光探测器（包括Andor iXon897EMCCD、Hamamatsu Flash4.0V2sCMOS和Hamamatsu Flash4.0V3sCMOS）的超分辨定位成像性能。首先，我们评估了相机依赖极大似然法（camera-specific MLE,csMLE）和普通极大似然法（即相机独立极大似然法，camera-independent MLE,ciMLE）的用途。基于固定荧光微球实验，我们发现，两种极大似然法对来自iXon897EMCCD的数据影响不大；而对两款sCMOS相机而言，峰值信号为每像素50~250光子时，csMLE的单分子定位精度略高于ciMLE。但随着信号的增强，这种差别将逐渐削弱直至消失。考虑到csMLE的计算复杂度，在大多数应用场景中，我们认为ciMLE的性能已经足够。当ciMLE用于单分子定位时，不同相机的单分子定位精度表现是：Flash4.0V3＞Flash4.0V2＞iXon897。此后，我们比较了三款探测器在运动荧光小球实验中的性能。我们使用ciMLE进行单分子定位，并将不同探测器记录到同一荧光小球的运动轨迹与实际荧光小球的真实荧光小球的运动曲线（来自二维纳米平移台）对比。我们发现，不同相机的定位精度表现是：Flash4.0V3＞Flash4.0V2＞iXon897。因此，我们的结果证实，sCMOS相机不仅仅可以提供比EMCCD更高的信噪比（rSNR），还可以提供更好的定位精度，因此更适合于作为超分辨定位成像的优选探测器。 （3）基于生物样品的探测器成像性能直接比较：利用细胞样品和组织样品，我们进一步直接比较了三种代表性弱光探测器的超分辨定位成像性能。在细胞样品实验中，我们发现，iXon897和Flash4.0V3两种探测器都能在保有相对完整的微管蛋白结构的同提供好的FRC分辨率。在组织样品对比实验中，我们发现Flash4.0V2的性能比iXon897更好。因此，我们证实sCMOS相机比EMCCD更适合于超分辨定位成像。

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