苦丁茶中二咖啡酰基奎宁酸对人肿瘤细胞的体外抑制作用及其机制研究

摘要

目的:筛选苦丁茶中对人乳腺癌细胞MCF-7和人胃癌细胞MGC-803有抑制作用的二咖啡酰基奎宁酸，观察其对人肿瘤细胞的体外生长抑制作用以及诱导凋亡的过程，运用RT-PCR的方法检测相关基因的表达情况，推测二咖啡酰基奎宁酸的抗肿瘤机理，并为二咖啡酰基奎宁酸的临床应用提供理论依据。
　　方法:1.二咖啡酰基奎宁酸的制备:苦丁茶水提物浓缩物用蒸馏水稀释后上D101大孔树脂，收集30％甲醇洗脱部位，减压浓缩、冷冻干燥后命名为Fr-1组分;Fr-1组分用60％甲醇溶解过滤后，在制备型高效液相上用Cosmosil C18柱分离，以水-甲醇为流动相，梯度洗脱，流速为8.0ml/min，按各峰形及出峰时间收集各洗脱溶液，冷冻干燥后分别命名A、B、C、D、E、F组分。通过对照标准品以及HPLC-LC-MS/MS串联技术对各组分进行结构鉴定。
　　2.采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法分别筛选出对MCF-7、MGC-803有抑制作用的二咖啡酰基奎宁酸，并检测不同给药时间和给药浓度对细胞生长的抑制率;通过流式细胞仪Annexin V-FITC/PI法检测不同浓度（100μg/ml、350μg/ml、600μg/ml）的3，4-二咖啡酰基奎宁酸作用于MCF-748h、不同浓度（200μg/ml、400μg/ml、600μg/ml）的3，5-二咖啡酰基奎宁酸作用于MGC-80324h后各组细胞凋亡率。
　　3.RT-PCT荧光定量法检测基因表达:不同浓度的3，4-二咖啡酰基奎宁酸、3，5-二咖啡酰基奎宁酸分别干预MCF-7、MGC-803细胞48h、24h后，收集细胞，用Trizol法提取总RNA，基因扩增产物用2％琼脂凝胶电泳，以β-actin为内参，检测细胞中C-myc、P53、Bcl-2、Bax等相关基因的表达情况，并探讨其可能的抑制肿瘤细胞生长机制。
　　结果:1.通过对比标准品液相色谱图以及对各组分化合物的结构鉴定，组分B为二咖啡酰基奎宁酸的混合物，组分C为3，4-二咖啡酰基奎宁酸，组分D为3，4-二咖啡酰基奎宁酸和4，5-二咖啡酰基奎宁酸的混合物，组分E为3，5-二咖啡酰基奎宁酸，组分F为4，5-二咖啡酰基奎宁酸，并通过面积归一化法计算C、E、F各组分中二咖啡酰基奎宁酸的纯度分别为91.44％、85.73％、98.56％。
　　2.对人乳腺癌细胞MCF-7的生长有抑制作用的为组分C(3，4-二咖啡酰基奎宁酸)，其抑制作用呈时间-剂量依赖性，当给药剂量为350μg/ml作用48h时对MCF-7的抑制率达到51.16％;对人胃癌细胞MGC-803有抑制作用的为组分E(3，5-二咖啡酰基奎宁酸)，其抑制作用呈时间-剂量依赖性，当给药剂量为400μg/ml作用24h时对MGC-803的抑制率达到59.41％。流式细胞仪Annexin V-FITC/PI法检测凋亡率发现，3，4-二咖啡酰基奎宁酸对MCF-7、3，5-二咖啡酰基奎宁酸对MGC-803的凋亡随着给药浓度的增加均有增高趋势，并呈时间-剂量依赖性。
　　3.RT-PCR结果显示，随着给药剂量的增加，3，4-二咖啡酰基奎宁酸可以明显上调MCF-7中P53基因，下调C-myc基因，与正常组细胞相比呈显著性差异(P＜0.05);MGC-803细胞中，随着3，5-二咖啡酰基奎宁酸给药剂量的增加，P53、Bax基因的相对表达逐渐上升，Bcl-2的表达则逐渐下降(P＜0.05)。
　　结论:3，4-二咖啡酰基奎宁酸能抑制人乳腺癌细胞MCF-7的生长和增值，诱导MCF-7发生凋亡，其作用机制可能通过上调P53、下调C-myc等诱导细胞凋亡的基因的表达有关;3，5-二咖啡酰基奎宁酸能抑制人胃癌细胞MGC-803的生长和增值，诱导MGC-803发生凋亡，其作用机制可能是通过上调P53、Bax基因，下调Bcl-2基因的相对表达从而诱导细胞凋亡。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一部分 苦丁茶中二咖啡酰基奎宁酸的提取、分离、纯化和鉴定

1．实验材料与仪器

2．实验方法

3．实验结果

4．讨论

5．小结

第二部分 苦丁茶中具有抗肿瘤活性的二咖啡酰基奎宁酸的筛选

1．实验材料与仪器

2．实验方法

3．实验结果

4．讨论

5．小结

第三部分 苦丁茶中二咖啡酰基奎宁酸抗肿瘤的机制探讨

1．实验材料与仪器

2．实验方法

3．实验结果

4．讨论

5．小结

结语

文献综述

参考文献

致谢