基于DNA条形码的细小种子类及含靛玉红类中药材的鉴定研究

摘要

我国药用动植物资源丰富，2010年版《中国药典》收录的中药多达600多种。然而由于南北差异和历史沿革等原因，同名异物的混淆品或代用品极多，严重影响了中药材的临床疗效和用药安全，一直是中药产业化、国际化的主要挑战之一。DNA条形码技术在解决这一问题上拥有自己独特的优势，2010年版《中国药典》增补本已收录中药材DNA条形码分子鉴定指导原则。本文以《中国药典》收录的直径小于2毫米的细小种子类中药材和含靛玉红类中药材为研究对象，基于ITS2序列探讨中药材DNA条形码分子鉴定法在实际鉴定工作中的操作流程及实际应用价值，得出以下结论：
　　（1）本实验以直径小于2毫米的车前子、青葙子、天仙子、葶苈子、菟丝子和王不留行6种细小种子类中药材及其混伪品为研究对象，共包含28个物种144份实验材料。用试剂盒法提取细小种子类中药材及其混伪品的144份样本的总DNA，通过PCR扩增其ITS2序列并双向测序。应用CodonCode Aligner v4.25对测序峰图进行校对拼接，去除低质量序列及引物区获得ITS2序列。用MEGA6.0软件计算物种种内和种间的K2P遗传距离，分析变异位点并构建邻接（NJ）系统聚类树。综合应用相似性搜索法、最近距离法以及NJ系统发育树等进行鉴定分析。结果显示，144份样本的ITS2序列的扩增效率和测序成功率均为100％，6种中药材9个基原物种的ITS2序列长度范围为194~221 bp。基于相似性搜索法，ITS2序列鉴定效率为88.9%。基于K2P模型计算遗传距离，平车前、车前、青葙、天仙子、独行菜、播娘蒿、菟丝子、南方菟丝子、麦蓝菜9个物种的最大种内遗传距离分别为0.005、0、0.009、0.005、0.010、0.021、0.005、0.034、0，小于9个物种的最小种间遗传距离0.047；平车前、车前、独行菜、播娘蒿、菟丝子、南方菟丝子和天仙子的最大种内遗传距离小于其与其混伪品的最小种间遗传距离；青葙的最大种内遗传距离等于其与其混伪品的最小种间遗传距离。NJ树图结果显示，除平车前和青葙外，其余的7个物种均能各自聚为一支，表现出良好的单系性，与混伪品明显的区分开。虽然基于NJ树图法，ITS2序列不能很好的区分平车前及其伪品大车前，但相似性搜索法和最近距离法的结果均证明ITS2序列能够鉴别平车前及其混伪品。因此，ITS2序列能够准确鉴别除青葙子以外的5种细小种子类中药材，为保障临床用药安全提供了有效的技术手段。
　　（2）本实验共收集57份菘蓝、蓼蓝、马蓝及其混伪品的样本。随机挑选24份菘蓝、蓼蓝、马蓝及其混伪品样本，并对其matK、rbcL、psbA-trnH和ITS2序列进行PCR扩增和测序，比较各序列扩增成功率、测序成功率、鉴定能力，结果显示ITS2序列是最理想的DNA条形码；PCR扩增和测序剩余的33份样品的ITS2序列，分析其种内、种间遗传距离，构建NJ系统聚类树。最小距离法及NJ系统聚类树图均表明 ITS2序列能准确鉴别菘蓝、蓼蓝、马蓝及其混伪品。另外，本研究应用高效液相色谱法检测菘蓝、蓼蓝、马蓝及其混伪品大青、木蓝、水蓼、火炭母、球花马蓝以及中药材青黛等31份样本中是否含有靛玉红成分。结果显示仅在中药材青黛和药用植物菘蓝、蓼蓝、马蓝的叶片中检测到靛玉红成分。
　　综上所述，DNA条形码分子鉴定法能够准确鉴定车前子、天仙子、葶苈子、菟丝子和王不留行5种细小种子类中药材；DNA条形码技术与高效液相色谱法相结合能够实现对含靛玉红类中药材及其混伪品的有效鉴定，为其它重要中药材的鉴定研究提供了新思路和新方法。

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前言

第一章 细小种子类中药材的DNA条形码研究

1材料与方法

1.1材料

1.2 实验方法

2 结果

2.1 ITS2序列PCR扩增及测序效率

2.2细小种子类中药材的ITS2序列特征

2.3 相似性搜索法鉴定结果

2.4 遗传距离分析

2.5 细小种子类中药材及其混伪品的NJ树鉴别

3 讨论

3.1 细小种子类中药材提取方法的探讨

3.2 应用ITS2序列鉴定细小种子类中药材的稳定性

3.3 细小种子类中药材的ITS2序列保守

3.4 ITS2序列在细小种子类中药材中的鉴定效率

3.5 DNA条形码在鉴定细小种子类中药材工作中的意义

第二章 含靛玉红类中药材的快速鉴定与成分验证

第一节 含靛玉红类中药材的DNA条形码鉴别研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第二节 菘蓝、蓼蓝、马蓝及其伪品的靛玉红成分分析

1 实验材料、仪器与试剂

2 方法与结果

3 讨论

结语与创新

附录

一、 附图

二、攻读硕士学位期间已发表论文

三、文献综述

参考文献

致谢