藏药材“欧贝”类绿绒蒿“清肝热、肺热”功效与活性化学物质相关性研究

摘要

研究背景和目的：
　　藏药材“欧贝”类绿绒蒿是罂粟科Papaveraceae绿绒蒿属Meconopsis多种植物的花，是在藏族地区具有悠久的使用历史和广泛应用的藏民族药材。据统计，约有120种藏药制剂使用绿绒蒿类药材入药。由于藏医临床根据藏医药典籍，仅以绿绒蒿植物的花入药，但花产量极低，野生资源不足；并且藏医“清肝热、肺热”主要只以紫色或蓝紫色花入药，黄色花和红色花不用或少用；另外，药材的过度采挖，使用面窄，导致绿绒蒿属一些关键药用物种已处于濒危状态；同时，绿绒蒿生长在海拔3000～5000米的高山草甸、高山灌丛、流石滩等脆弱生态环境中，生长期短，野生植物资源珍稀，仅以产量极低的花入药，造成了该类植物的资源巨大浪费，但是以植珠同等入药又无确切依据和科学实验数据支撑。因此，开展野生绿绒蒿属药用植物资源的研究，为部分资源丰富的绿绒蒿物种植珠及不同花色的物种同等入药提供依据，以期解决仅以产量极低的紫色或蓝色花入药的困境，对避免藏医临床用量最大的“清肝热、肺热”的“欧贝”类紫色或蓝紫色花的绿绒蒿野生植物资源濒临灭绝，保障绿绒蒿药材和藏药经典成方制剂中绿绒蒿配伍的有效供给具有重要意义。
　　黄色花的全缘叶绿绒蒿 Meconopsisintegrifolia(Maxim.)Franch、红色花的红花绿绒蒿M. puniceaMaxim和蓝紫色花的川西绿绒蒿M.henriciBur.et Franch为藏药经典巨著《月王药诊》、《四部医典》和《晶珠本草》等记载的多基源药材“欧贝”类绿绒蒿的三个来源物种，本课题通过比较三种不同花色的绿绒蒿植株对肝损伤和肺损伤的活性、不同花色的绿绒蒿花对炎症细胞的活性、花和植株提取物体外抗氧化活性研究，筛选出抗氧化活性最强、对肝损伤和炎症细胞作用效果较好的、目前野生植物资源较丰富的全缘叶绿绒蒿进行深入研究；利用UPLC-MS/MS技术、HSCCC技术对全缘叶绿绒蒿的主要化学成分进行研究，采用谱-效关系法初步确定活性指纹图谱中各色谱峰与抗氧化作用的相关性，确立活性物质，揭示全缘叶绿绒蒿的活性化学成分。
　　方法与结果：
　　1.藏药材绿绒蒿的生药鉴别研究
　　采用原植物和药材性状比较，光镜（OM）法观察根、花葶、叶、花的内部组织结构显微特征，扫描电镜（SEM）法观察花粉粒形态对三种绿绒蒿进行鉴别。结果表明：（1）原植物和性状特征可根据花颜色不同或植株大小区分；（2）显微组织结构特征可根据根的木质化程度和叶的主脉维管束差异鉴别；（3）粉末特征以花粉囊内壁细胞的特征差异最为明显；（4）花粉粒表面特征：全缘叶绿绒蒿和红花绿绒蒿的花粉粒为球形或近球形，无萌发孔，全缘叶绿绒蒿花粉粒上的刺状突起较红花绿绒蒿钝，红花绿绒蒿花粉粒表面比全缘叶绿绒蒿平滑；川西绿绒蒿花粉粒类型为3孔沟，表面具刺状雕纹。因此，三种绿绒蒿的原植物、性状、内部显微组织结构、粉末特征、花粉粒表面特征等区别明显，可为藏医临床常用的三种绿绒蒿药材的鉴别提供参考依据。
　　2.大孔树脂富集纯化藏药材全缘叶绿绒蒿总黄酮的工艺研究
　　以总黄酮含量为考察指标，对AB-8、D101、HPD450和HPD6004种大孔树脂富集纯化全缘叶绿绒蒿植株总黄酮的吸附和解吸性能进行评价。D101树脂纯化全缘叶绿绒蒿植株总黄酮的最佳条件为：上样质量浓度0.30 g生药/mL，洗脱液体积流量为3 BV/h，最佳吸附容量为51.2 mL/g，以4 BV蒸馏水洗脱去除杂质后，换用50％乙醇4 BV洗脱。经过D101大孔吸附树脂富集和纯化后，全缘叶绿绒蒿总黄酮的纯度由2.47%上升至33.83%，回收率为91.35%。所建立的D101大孔吸附树脂富集和纯化全缘叶绿绒蒿总黄酮的方法简单可行，可为绿绒蒿植株提取物的活性对比研究提供实验基础。
　　3.三种不同花色绿绒蒿花和植株抗氧化活性和“清肝热、肺热”功效研究
　　3.1三种不同花色绿绒蒿花的醇提物和植株总黄酮体外抗氧化作用研究
　　采用紫外分光光度法测定三种绿绒蒿花的提取物和植株（不带花）总黄酮中的总多酚和总黄酮含量，测定三种绿绒蒿花70%乙醇提取物和三种绿绒蒿植株总黄酮对DPPH自由基和ABTS自由基的清除能力、总抗氧化能力和抑制超氧阴离子自由基能力，以比较研究三种不同花色绿绒蒿花70%乙醇提取物和绿绒蒿植株总黄酮的体外抗氧化作用。结果表明，全缘叶绿绒蒿花的70%乙醇提取物和全缘叶绿绒蒿植株的总多酚、总黄酮含量最高，总抗氧化能力、DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力均最强；川西绿绒蒿植株总黄酮抑制超氧阴离子自由基的能力最强；三种不同花色绿绒蒿花70%乙醇提取物具有促进产生超氧阴离子自由基生成的作用。全缘叶绿绒蒿花的醇提取物和植株提取物对多种自由基具有很强的清除作用，在氧化应激方面疾病的治疗有很好的应用前景，为绿绒蒿植株提取物代替花入药提供科学依据。
　　3.2三种不同花色绿绒蒿花的醇提取物对LPS诱导RAW264.7细胞炎症作用的比较研究
　　比较三种不同花色绿绒蒿花的醇提取物对LPS诱导RAW264.7细胞炎症作用的差异。采用1μg/mLLPS诱导RAW264.7细胞炎症，CCK-8法检测细胞活性，Griess法测定NO的含量，ELISA法测定细胞分泌的TNF-α、IL-6、IL-10含量，荧光酶标仪检测细胞Caspase3/7表达，DCFH-DA法测定细胞内ROS水平。当花的醇提取物浓度小于50μg/mL时，三种绿绒蒿花醇提取物对细胞无明显毒性作用，超过该浓度则有一定的细胞毒性；三种绿绒蒿花的醇提取物对NO的生成有促进作用；高浓度的三种绿绒蒿花的醇提取物对细胞分泌的TNF-α有一定的抑制作用；低浓度的全缘叶绿绒蒿花醇提取物（20μg/mL）能显著抑制IL-6的生成，低浓度的红花绿绒蒿花的醇提取物对IL-6有一定的抑制作用，高浓度的川西绿绒蒿花醇提取物（200μg/mL）对IL-6有显著的抑制作用；低浓度的三种绿绒蒿花醇提取物（20μg/mL）对IL-10有显著的促进作用；三种绿绒蒿花醇的提取物对LPS致炎的RAW264.7细胞Caspase3/7的表达有抑制作用；三种绿绒蒿花的醇提取物均能显著降低炎症细胞产生的ROS，以全缘叶绿绒蒿花醇提取物的作用效果最好。结果表明，三种不同颜色绿绒蒿花的醇提取物均对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症有一定的抑制作用，其中全缘叶绿绒蒿花的醇提取物对细胞炎症导致的氧化应激反应抑制效果最好，为三种花色绿绒蒿能否等同入药提供科学依据。
　　3.3三种不同花色绿绒蒿植株总黄酮对小鼠肝损伤保护作用的比较研究
　　比较三种不同花色绿绒蒿植株总黄酮对小鼠肝损伤的改善作用，初步证明不同花色绿绒蒿植株总黄酮可等同入药用于肝病治疗。采用刀豆蛋白A构建小鼠肝损伤模型，两种剂量（0.1、0.3 g/kg）给药，连续6天，试验结束后，检测血清中谷丙转氨酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）含量；检测肝组织中超氧化物歧化酶（SOD）、还原型谷胱甘肽（GSH）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）的活力或含量；观察肝组织HE染色的变化。结果表明，三种绿绒蒿植株总黄酮能显著降低血清中ALT、AST、LDH水平（P<0.05或P<0.01），升高肝组织中SOD活性，降低MDA含量，但对组织中GSH、CAT作用效果不明显；川西绿绒蒿植株总黄酮能改善肝组织的病理学改变。三种绿绒蒿植株总黄酮都有一定的肝保护作用，紫色花的川西绿绒蒿对肝损伤的保护作用效果最好，全缘叶绿绒蒿对SOD活性升高最明显，可有效缓解因肝损伤导致的氧化应激。
　　3.4三种不同花色绿绒蒿提取物对脂多糖致小鼠肺损伤的作用
　　比较三种不同花色绿绒蒿提取物对小鼠肺损伤的作用。用吸入脂多糖（LPS）的方法构建小鼠肺损伤模型，采用肺组织HE染色评价小鼠肺部炎症，肺湿/干重比值（W/D）评价肺组织的水肿程度，ELISA法测定血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平，检测肺组织中SOD、MDA和MPO含量。结果表明，红花绿绒蒿提取物对LPS引起的急性肺炎而导致的病理形态改变具有显著的改善作用；与正常对照组相比，LPS组W/D比值显著升高，但三种绿绒蒿提取物并不能明显降低肺损伤小鼠肺的W/D比值；三种绿绒蒿提取物能不同程度降低血清中TNF-α含量和升高肺组织中SOD活性，但对血清中IL-1β、IL-6和肺组织中MDA、MPO含量无明显影响。结果表明，红花绿绒蒿对小鼠肺损伤有一定的保护作用，全缘叶绿绒蒿和川西绿绒蒿的作用效果不明显。因此，藏医较少使用绿绒蒿药材用于肺部疾病的治疗有一定科学依据。
　　4.高速逆流色谱法分离纯化藏药材全缘叶绿绒蒿花的黄酮类成分
　　应用高速逆流色谱（HSCCC）法分离制备全缘叶绿绒蒿花中的黄酮类成分，初步阐明全缘叶绿绒蒿花的化学成分组成。以乙酸乙酯/正丁醇/水（2∶3∶5，v/v/v）为溶剂系统，循环水浴温度35℃，UV检测波长254nm，转速900 r/min，正转，流速2.0 mL/min。从600 mg粗提物中分离得到60 mg槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-(1→6)-β-D-葡萄糖苷（1），40 mg槲皮素-3-O-[2'''-O-乙酰基-β-D-葡萄糖-(1→6)-β-D-葡萄糖苷]（2），11 mg槲皮素-3-O-[3'''-O-乙酰基-β-D-葡萄糖-(1→6)-β-D-葡萄糖苷]（3），16 mg槲皮素-3-O-[6'''-O-乙酰基-β-D-葡萄糖-(1→6)-β-D-葡萄糖苷]（4），纯度分别为98%、95%、90%、92%，所得化合物经 MS和NMR确认结构式。4个化合物均首次从全缘叶绿绒蒿分离得到，其中3和4为新发现的乙酰化槲皮素苷。
　　5.全缘叶绿绒蒿谱效关系及质量评价研究
　　5.1全缘叶绿绒蒿抗氧化作用的谱效关系研究
　　探讨全缘叶绿绒蒿植株总黄酮的抗氧化作用与其UPLC指纹图谱间的谱-效关系，初步阐明其活性物质基础。采用UPLC法获取全缘叶绿绒蒿植株总黄酮的指纹图谱，应用紫外分光光度法检测全缘叶绿绒蒿植株总黄酮对DPPH自由基和ABTS自由基清除能力、总抗氧化能力、抑制超氧阴离子自由基能力进行测定，利用主成分分析和灰色关联度分析法对色谱-抗氧化能力数据进行相关分析，采用UPLC-MS/MS分析全缘叶绿绒蒿植株总黄酮的主要化学成分。结果从UPLC指纹图谱中共提取出29个能够标示全缘叶绿绒蒿植株总黄酮的共有峰，通过主成分分析选出DPPH自由基清除能力和抑制超氧阴离子自由基能力两个指标的数据与29个共有峰进行关联，将关联度大于0.7的共有峰初步认为是全缘叶绿绒蒿植株总黄酮抗氧化的主要活性成分，认为全缘叶绿绒蒿植株总黄酮抗氧化作用为多个化合物协同作用的结果。通过UPLC-MS/MS分析得知全缘叶绿绒蒿植株总黄酮提取物中主要化合物为槲皮素的糖苷，另含有少量生物碱。
　　5.2 UPLC法测定全缘叶绿绒蒿花的主要成分的含量
　　通过建立同时测定全缘叶绿绒蒿花中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-(1→6)-β-D-葡萄糖苷（RS1）、槲皮素-3-O-[2'''-O-乙酰基-β-D-葡萄糖-(1→6)-β-D-葡萄糖苷]（RS2）和异槲皮苷（RS3）的UPLC法，以评价全缘叶绿绒蒿花药材。色谱条件参照前期UPLC分离全缘叶绿绒蒿花提取物已建立的色谱条件。ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（2.1×100 mm，1.8μm），柱温35℃，流速300μL/min，进样量2μL，检测波长范围210～400 nm，流动相：乙腈（A）～0.1%冰醋酸水（B），等度洗脱，0～10 min，16%A。结果表明，RS1、RS2和RS3分别在0.02504～0.5008 mg/mL（R2=1.0000）、0.02502～0.5004 mg/mL（R2=0.9999）、0.006275～0.2008 mg/mL（R2=0.9998）呈良好线性关系；平均回收率分别为103.39%、102.13%、90.36%，RSD%均小于2.83%。该方法简单、快速、准确，可作为全缘叶绿绒蒿花的主要化学成分含量测定的方法。结果表明，在所采集的样品中，全缘叶绿绒蒿花的主要成分含量与产地、海拔、采收月份均有关系，以小金县和马尔康县海拔较高地区5～6月份采集的全缘叶绿绒蒿花品质较好。
　　结论：
　　1.花的颜色、植株大小、根的差异、花粉囊内壁细胞差异、花粉粒特征可作为三种绿绒蒿的生药鉴定依据。
　　2.川西绿绒蒿的植株有很好的肝损伤保护作用，可建议将植株与花等同入药治疗肝病。黄色花的全缘叶绿绒蒿花和植株都有很强的抗氧化活性，对动物肝损伤也有很好的保护作用，建议将其花和植株与蓝紫色花的川西绿绒蒿等同入药。
　　3.首次采用HSCCC法对全缘叶绿绒蒿花提取物的主要化学成分进行分离纯化，从中得到4个化合物，均为首次从全缘叶绿绒蒿中得到，有2个化合物为新发现的化合物。
　　4.首次采用谱-效关系研究全缘叶绿绒蒿的抗氧化活性成分，发现其主要活性成分为槲皮素糖苷，并且全缘叶绿绒蒿植株与花中有相似的成分组成。
　　5.首次采用UPLC法评价藏药材全缘叶绿绒蒿花，在川西高原以小金县和马尔康县海拔较高地区的花品质更优。

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缩略词表

前言

第一章 藏药材绿绒蒿的生药鉴别研究

1 材料与方法

2 方法与结果

3 讨论

第二章 大孔树脂富集纯化藏药材全缘叶绿绒蒿总黄酮的工艺研究

1 仪器与材料

2 方法与结果

3 讨论

第三章 三种不同花色绿绒蒿花和植株抗氧化活性和“清肝热、肺热”功效研究

第一节 三种不同花色绿绒蒿花的醇提取物和植株总黄酮体外抗氧化作用研究

第二节 三种不同花色绿绒蒿花的醇提物对LPS诱导RAW264.7细胞炎症作用的比较研究

第三节 三种不同花色绿绒蒿植株总黄酮对小鼠肝损伤保护作用的比较研究

第四节 三种不同花色绿绒蒿提取物对脂多糖致小鼠肺损伤的作用

第四章 高速逆流色谱法分离纯化藏药材全缘叶绿绒蒿花的黄酮类成分

1 材料

2 方法

3 结果与分析

4 讨论

第五章 全缘叶绿绒蒿谱效关系及质量评价研究

第一节 全缘叶绿绒蒿抗氧化作用的谱效关系研究

第二节 UPLC法测定全缘叶绿绒蒿花主要成分的含量

结语

1 结语

2 下一步工作打算

参考文献

附录文献综述

1 绿绒蒿属植物化学成分和药理活性研究进展

2 高速逆流色谱技术在天然产物研究中的应用

参考文献

附图

博士研究生期间获得的成果

致谢