基于转录组学的茅苍术种质资源研究

摘要

茅苍术 Atractylodes lancea( Thunb.) DC.系菊科苍术属多年生草本植物，是中药苍术的基原植物之一，主产于湖北、江苏、河南等地，为我国常用中药材。由于茅苍术市场需求与日俱增，导致传统道地产区江苏茅山的野生资源遭到严重破坏。目前市场上茅苍术商品主要来自湖北英山等地的栽培品。本文从转录组学角度研究江苏茅山县和湖北英山县所产的茅苍术资源特性及品质差异，克隆并分析萜类生物合成关键基因，旨在筛选出茅苍术优质资源，阐述药材的道地性。主要研究内容如下。 1.基于 RNA-Seq的茅苍术种质资源研究。利用 Illumina HiSeq2000测序平台，对两个产地的茅苍术根茎和叶共10个样品开展转录组测序，并对测序结果进行分析。结果发现，江苏茅山（JL）和湖北英山(YL)茅苍术叶转录组有效数据（ clean reads）分别为118,397,448和91,761,748，江苏茅山(JR)和湖北英山(YR)茅苍术根茎部位clean reads分别为152,688,850和110,478,126。序列组装后获得unigenes125711条。利用blastx、blastp、SwissProt、TrEMBL和kegg等公共数据库对所有的 unigenes进行比对及功能注释，共注释到73785（58.69%）条unigene，其中34406(27.37%)条unigene被gene ontology富集分析归类到一个或多个GO项下，9700(7.72%)条Unigene被映射到 KEGG数据库的参考代谢通路中。不同产地茅苍术基因差异表达分析显示，JL、JR相对于YL、YR的差异表达基因（DEG）数目分别为4087、2118条，这些DEG的KEGG分析结果中与初生代谢紧密相关的3条初生代谢途径，即ko00500（淀粉和蔗糖的代谢）、ko00010（糖酵解）和 ko00710（光合作用中碳的固定）进行进一步分析发现，每个途径中分别存在40、19、18条差异基因；同时分析2条与次生代谢产物萜类化合物的合成有关的代谢通路ko00900（萜类骨架的生物合成）和 ko00909（倍半萜和三萜的生物合成），分别存在7条和4条差异基因。从以上结果可以看出，茅山和英山的茅苍术基因表达存在较大差异，因此造成两地茅苍术的种质资源差异。本研究为中药材的种质资源研究探索了新途径，同时为后续茅苍术萜类合成酶基因的研究奠定了基础。 2.茅苍术倍半萜合酶基因（AlTPS1）的克隆与表达分析。基于上述转录组数据，找到一个茅苍术倍半萜合酶基因的片段序列，然后利用 cDNA末端快速扩增（RACE）技术对该序列的进行3’RACE和5’RACE扩增，从而得到茅苍术倍半萜合酶基因的全长序列（命名为AlTPS1）。对AlTPS1进行序列分析得到该基因全长1644 bp，编码氨基酸547个。运用 RT-qPCR方法，检测倍半萜合酶基因在茅苍术不同组织中的表达量，结果显示该基因在花和叶中的表达量较高，根茎中的表达量较低，根中基本无表达。通过构建重组表达载体Pet28a-AlTPS1，同时用IPTG诱导其在大肠杆菌中表达，发现该基因表达的蛋白大小为64KD。本文首次得到了 AlTPS1基因的全长序列，对该基因的生物信息学、组织特异性表达和蛋白表达做了初步分析，为茅苍术倍半萜类成分的生物合成途径的研究提供了研究基础。 3.茅苍术DXS基因的克隆与分析。基于上述转录组数据，筛选到一个萜类骨架合成途径的关键基因1-脱氧木糖-5-磷酸合酶（DXS,1-deoxy-D-xylulose5-phosphate synthase）序列。克隆得到茅苍术DXS基因的cDNA序列，对DXS基因的cDNA序列分析得到该基因全长为2151bp，编码716个氨基酸。同时在 GenBank注册得到登录号为KY659208。对 DXS基因的氨基酸序列进行系统发育分析，结果显示该序列与甜叶菊等菊科植物DXS基因有较高的同源性。利用qPCR法检测茅苍术DXS的组织特异性，结果表明该基因在叶片中表达量最高，其次为花，而在根茎和根中表达很低。研究主要获得了茅苍术DXS基因的全长cDNA序列，对其进行了初步生物信息学分析，揭示了其组织差异性表达特征，为进一步阐述该基因在茅苍术萜类成分生物合成途径中的功能奠定了基础。

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英文缩略词表

前言

第一章 基于RNA-Seq的茅苍术种质资源研究

1. 实验材料和仪器

2.实验方法

3.实验结果

4.讨论

第二章 茅苍术AlTPS1基因的克隆和表达分析

1.实验材料和仪器

2.实验方法

3．实验结果与分析

4．讨论

第三章 茅苍术DXS基因的克隆与分析

1．实验材料和仪器

2．实验方法

3．结果与分析

4.讨论

结语与创新

参考文献

文献综述：茅苍术转录组学及种质资源评价研究概况

附录

致谢