不同解磷菌配比解磷能力比较及解无机磷基因的克隆

摘要

磷素是植物生长的重要限制因子，单纯依靠大量施用磷肥来解决磷素缺乏已经出现资源浪费、环境污染等诸多弊端。解磷微生物在土壤中磷循环相关的生物学系统中担任着重要的角色，它可以将难溶磷素转化为可溶性磷，提高磷肥利用率，本论文围绕解磷微生物开展相关工作，取得以下结果： 本试验通过平板检测法、磷钼蓝比色法对黑龙江大学微生物重点实验室提供的九株解磷菌的解磷能力进行检测，以菌种和解磷能力为依据，选取五株解磷能力较强的菌株HDBP2、HDBP5、HDBP6、HDFPI和HDAPI，分别两两以1:1，1:2和2:1的体积进行配比，测定配比后培养液中可溶性磷含量并比较解磷能力。 试验表明，试验用所有解磷菌株都能在以Ca<,3>(PO<,4>)<,2>或卵磷脂为唯一磷源的平板中形成菌落，说明这九株菌都能分解Ca<,3>(PO<,4>)<,2>或卵磷脂供其自身生长发育。在无机磷平板上，HDBP5、HDBP6、HDFP1和HDAP1的菌落的四周均出现了较明显的透明圈：在有机磷平板上，HDBP5和HDAP1的菌落的四周出现了较明显的透明圈。液体培养时，以HDBP2：HDBP5=2:1时解无机磷能力最强，培养液中可溶性磷含量可达到90.25μg/mL。 目前对解磷细菌解无机磷基因的研究较少，公开发表的文章局限于细菌产酸途径中的调节基因。其中PQQ(吡咯喹啉醌)合成基因(pqqE)最具代表性，其编码产物可以促进细菌对无机磷的溶解利用。本试验根据GenBank上发表的蜡状芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌的pqqE基因序列，利用primer premier 5软件设计引物，进行了HDBP1、HDBP2、HDBP4和HDBP5四株菌的pqqE基因的克隆。 通过对HDBP1和HDBP2进行细菌解无机磷基因的克隆得到了大小为494bp的PqqE基因片段，分别与GenBank中苏云金芽孢杆菌的pqqE基因序列比对，同源性分别达到93.52％和93.72％；通过对HDBP4和HDBP5进行细菌解无机磷基因的兜降得到了大小为494bp的pqqE基因片段，分别与蜡状芽孢杆菌的pqqE基因序列比对，同源性分别达到95.34％和95.55％。

目录

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声明

第1章绪论

1.1磷素的生物学意义

1.1.1磷是作物体内重要的有机化合物组分

1.1.2加强光合作用和碳水化合物的合成与运转

1.1.3促进氮素的代谢

1.1.4促进脂肪代谢

1.1.5提高作物对外界环境的适应性

1.2 土壤中磷的形态及有效磷的稀缺问题

1.2.1土壤中磷的形态

1.2.2有效磷的稀缺问题

1.3微生物在磷素循环中的作用

1.3.1土壤微生物生物量磷

1.3.2微生物在磷素循环中的作用

1.4解磷微生物

1.4.1解磷微生物定义

1.4.2解磷微生物的数量和种群结构

1.4.3解磷效果的研究方法

1.4.4微生物溶解无机磷的机制

1.4.5微生物溶解有机磷的机制

1.4.6细菌磷代谢的分子调控

1.5解磷微生物研究进展

1.6解磷微生物研究展望

1.7研究目的及试验路线

1.7.1研究目的

1.7.2研究内容

第2章材料与方法

2.1材料

2.1.1供试菌株和质粒

2.1.2引物的设计与合成

2.1.3培养基

2.1.4试剂及配制方法

2.1.5试剂盒

2.1.6主要仪器设备

2.2试验方法

2.2.1平板检测微生物解磷能力

2.2.2液体培养法测定微生物解磷能力

2.2.3不同解磷菌配比解磷能力测定

2.2.4细菌解无机磷基因的克隆

第3章结果与分析

3.1平板检测微生物解磷能力

3.1.1平板检测微生物解无机磷能力

3.1.2平板检测微生物解有机磷能力

3.2解磷微生物生长过程中解磷量的动态变化

3.2.1磷标准曲线的绘制

3.2.2不同菌株配比解无机磷动态变化

3.2.3不同菌株配比解有机磷动态变化

3.3反应前后培养液pH变化

3.3.1解无机磷反应前后培养液pH变化

3.3.2解有机磷反应前后培养液pH变化

3.4细菌解无机磷基因的克隆

3.4.1 PCR扩增产物的检测

3.4.2连接载体及克隆结果的检测

3.5讨论

3.5.1平板检测产生透明圈

3.5.2磷钼蓝比色

3.5.3配比对解磷能力的影响

3.5.4 PCR反应条件的选择

3.5.5 解无机磷反应前后pH变化

3.5.6解有机磷反应前后pH变化

结论

参考文献

致谢

附录