鸡新城疫减毒活疫苗壳聚糖纳米粒的制备及其免疫效果的研究

摘要

新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的一种急性、高度接触性禽类传染病,对养禽业造成的损害十分严重,被国际兽医局定为Ⅰ类传染病。对于ND的预防免疫接种,常用的疫苗是传统的弱毒活疫苗和灭活疫苗,但二者在实际应用中均具有一定的局限性。弱毒苗由于变异等易产生毒力返祖；灭活苗起效慢,免疫保护期短。因此,如何提高ND疫苗的免疫效果是疫苗免疫研究中迫切需要攻克的课题,剂型的改造是提高ND疫苗免疫效果的方法之一。目前,正在发展的纳米粒黏膜免疫递送系统是解决上述问题的最有希望的途径之一。
　　 本试验研究选用生物可降解材料壳聚糖为载体,以鸡新城疫减毒活疫苗为模型药物,采用离子交联法制备鸡新城疫减毒活疫苗壳聚糖纳米粒(NDV-Chs-NPs),并对纳米粒的处方、工艺及影响因素、理化特性、药物稳定性等进行了较为系统的研究；同时,通过Western blotting考察了NDV-Chs-NPs中NDV结构蛋白的抗原性；通过细胞毒性试验和安全检验评价了NDV-Chs-NPs黏膜免疫递送系统的安全性；通过效力检验和攻毒试验考察了其在鸡体内的免疫效果。试验结果表明,采用本试验筛选出的工艺制备出了大小均一、形态规则、外形圆整、分散性好的NDV-Chs—NPs,平均粒径为371.1nm,Zeta电位为+2.84mV,包封率为(74±3.7)％;Western blotting试验结果表明,NDV被壳聚糖包裹后,NDV结构蛋白没有受到破坏,保持了生物学活性；体外释放试验结果表明,NDv-Chs-NPs具有稳定缓释NDV的作用；鸡体内免疫接种试验结果表明,采用制备的NDV—Chs-NPs免疫后可刺激机体产生较强的体液免疫和细胞免疫,保护效力优于新城疫常规弱毒苗；细胞毒性试验和安全检验结果表明,NDV-Chs—NPs的毒性较小,NDV-Chs-NPs黏膜免疫递送系统具有较高的安全性。
　　 本试验研究可实现疫苗在体内的长效作用机制,从而达到降低免疫用药成本、减少免疫次数、增加免疫途径的目的。同时,也可为鸡新城疫疫苗在临床的广泛应用提供一个免疫效果好和安全性能高的黏膜免疫递送系统。

目录

文摘

英文文摘

第1章 前言

1.1 新城疫概述

1.1.1 新城疫病毒

1.1.2 新城疫的流行情况

1.1.3 新城疫的诊断与控制

1.1.4 新城疫疫苗

1.2 药物控制释放体系

1.2.1 靶向给药

1.2.2 药物控制释放中的突释现象

1.3 生物降解高分子材料的类型和特性

1.3.1 聚酯类

1.3.2 壳聚糖

1.3.3 海藻酸钠

1.3.4 环糊精

1.3.5 明胶

1.4 生物降解高分子材料的载体形式与特点

1.4.1 微粒

1.4.2 纳米粒

1.5 纳米粒的制备方法

1.5.1 乳化溶剂挥发法

1.5.2 离子交联法

1.5.3 共价交联法

1.5.4 沉淀析出法

1.5.5 聚电解质复合法

1.6 纳米疫苗研究现状

1.6.1 在核酸疫苗中的研究现状

1.6.2 在蛋白及多肽类疫苗中的研究现状

1.7 本课题研究的目的意义及主要内容

第2章 材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1 病毒

2.1.2 疫苗

2.1.3 试验动物

2.1.4 主要生化与分子生物学试剂

2.1.5 主要仪器设备

2.1.6 常用溶液的配制

2.2 试验方法

2.2.1 鸡新城疫病毒La Sota系的纯化

2.2.2 NDV-Chs-NPs的制备

2.2.3 NDV-Chs-NPs制备条件的优化

2.2.4 NDV-Chs-NPs形态、粒径分布和Zeta电位检测

2.2.5 NDV-Chs-NPs包封率的测定

2.2.6 Western-blotting检测NDV-ChS-NPs中病毒结构蛋白抗原性

2.2.7 NDV-Chs-NPs的体外释放特性

2.2.8 NDV-Chs-NPs的安全性评价

2.2.9 NDV-Chs-NPs中病毒含量测定

2.2.10 NDV-Chs-NPs的免疫效果评价

第3章 结果与分析

3.1 NDV-Chs-NPs制备条件的优化

3.1.1 单因子试验

3.1.2 正交试验

3.2 优化的NDV-Chs-NPs制备工艺

3.3 NDV-Chs-NPs形态、粒径分布、Zeta电位测定

3.4 NDV-Chs-NPs包封率测定

3.5 NDV-Chs-NPs中病毒结构蛋白的抗原性测定

3.6 NDV-Chs-NPs的体外释放试验

3.7 NDV-Chs-NPs的安全性评价

3.7.1 NDV-Chs-NPs的细胞毒性检测

3.7.2 NDV-Chs-NPs的安检试验

3.8 NDV-Chs-NPs中病毒含量测定

3.9 NDV-Chs-NPs的免疫效果评价

3.9.1 鸡血清抗体IgG检测

3.9.2 攻毒保护试验

第4章 讨论

第5章 结论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文情况

攻读硕士学位期间参与研究课题情况