紫花苜蓿离体再生体系建立和转录因子CBF2基因转化的研究

摘要

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是豆科多年生草本植物，营养丰富，已成为我国“三元”种植结构调整的首选饲料作物，为扩大种植区域，生产上急需抗寒、抗旱、耐盐的新品种。利用植物基因工程方法提高苜蓿抗逆性是现代育种的重要途径。
　　本研究以肇东紫花苜蓿和Pleven6紫花苜蓿为实验材料，建立一套适宜的苜蓿离体再生体系，通过农杆菌介导法将由rd29启动子调控的转录因子CBF2对其进行转化，以提高苜蓿的抗逆性。研究结果如下：
　　1．建立了适宜的肇东紫花苜蓿和Pleven6紫花苜蓿离体再生体系。
　　以7日苗龄的肇东苜蓿和9日苗龄的Pleven6苜蓿的子叶作为外植体最为适宜，诱导率为92.5％和86.7%，分化率为70.3%和62.5%。最佳愈伤诱导培养基：肇东苜蓿为 MS+2.0mg/L2,4-D+0.5mg/L KT+3%蔗糖，Pleven6为MS+1.5mg/L2,4-D+0.5mg/LKT+3%蔗糖；分化培养基：MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/L NAA+3%蔗糖；分化继代培养基：MS+0.3mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+0.3mg/LKT+3%蔗糖；生根培养基：1/2MS+0.5mg/LNAA+1.5%蔗糖。
　　2．建立了发根农杆菌介导的紫花苜蓿遗传转化的体系
　　以苜蓿的子叶作为外植体，预培养2d后用发根农杆菌R1000侵染，菌液浓度为OD600值0.3～0.4、侵染时间肇东苜蓿为15min、Pleven6苜蓿为10 min，共培养3d后，用150 mg/L的Sm脱菌，采用40mg/L的延迟筛选，筛选过程中Sm浓度从150mg/L逐渐降低至50mg/L，Km浓度由40mg/L降至15mg/L。
　　3．转基因苜蓿的获得
　　共培养法转化苜蓿的子叶外植体数共240个，得到了生根的抗性再生植株37株，其中肇东苜蓿21株和Pleven6苜蓿16株。经过PCR检测阳性植株为23株，肇东苜蓿14株和Pleven6苜蓿9株，转化率分别为66.7%和56.3%。
　　整株转化法转化的肇东苜蓿和Pleven6苜蓿各30株，经过PCR检测阳性植株肇东苜蓿21株和Pleven6苜蓿19株，转化率分别为70%和63.3%。
　　4．对转基因苜蓿进行生理指标的测定。
　　转基因苜蓿可溶性糖、可溶性蛋白、游离脯氨酸的含量不同程度的高于对照组，尤其在进行低温、干旱、盐碱胁迫后含量明显高于对照组，说明转基因苜蓿抗逆性得到了提高。

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第一章 绪论

1.1 苜蓿的概述

1.2 CBF转录因子的研究

1.3 苜蓿组织培养

1.4 遗传转化的研究

1.5 本课题的目的意义

1.6 本课题的创新点

第二章 紫花苜蓿离体再生体系的建立

2.1 材料

2.2 实验方法

2.3 结果与分析

2.4 讨论

2.5 本章小结

第三章 发根农杆菌介导的紫花苜蓿遗传转化

3.1 材料

3.2 实验方法

3.3 结果与分析

3.4 讨论

3.5 本章小结

第四章 转基因苜蓿的检测与鉴定

4.1材料

4.2 实验方法

4.3 结果与分析

4.4 讨论

4.5 本章小结

结论

1 建立了适宜的肇东紫花苜蓿和Pleven6紫花苜蓿紫花离体再生体系

2 建立了肇东苜蓿和Pleven6苜蓿遗传转化体系

3 用发根农杆菌介导法将CBF2基因转化苜蓿，并得到了抗性植株

4 肇东苜蓿和Pleven6苜蓿紫花苜蓿转基因植株的鉴定

参考文献

致谢

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