蓝藻NDH-CET的生理功能及其分子调控机制研究

摘要

NADPH脱氢酶（NDH-1）介导的围绕光系统I的循环电子传递（NDH-CET）在蓝藻循环电子途径中扮演着极其重要的角色。通常，在高光等胁迫条件下，NDH-CET能够大大增加和产生额外ATP，从而增强了蓝藻细胞应对胁迫环境的能力。然而，人们至今对蓝藻细胞在胁迫条件下如何调控NDH-CET活性的分子调控机制和抵御多种环境胁迫（例如高温）的实例尚了解不够。
　　一方面，为了找到NDH-CET调控相关的蛋白，在高光条件下，对集胞藻6803转座子插入突变体库进行筛选，获得两个高光下生长较快且NDH-CET活性增强的突变体。经鉴定在这两个突变体中转座子插入同一个基因--ssl1690；该基因编码NDH-1复合体NdhO亚基。以上结果暗示着在蓝藻细胞中NdhO可能抑制NDH-CET活性。随后分别构建获得了ndhO基因的突变株ΔndhO和过表达株OX-ndhO，并分析了两个株系中NDH-CET活性变化。结果表明ndhO基因的缺失提高了NDH-CET的活性，相反过表达ndhO基因削弱了NDH-CET的活性，证明在蓝藻细胞中NdhO抑制NDH-CET活性。进一步，ndhO基因的缺失或过表达并不影响Ndh亚基的表达。然而，ndhO基因的缺失增加类囊体膜上NDH-1中复合体（NDH-1M）的积累；相反，过表达ndhO基因降低了NDH-1M上的积累。以上结果表明NdhO通过降低NDH-1M的稳定性，抑制NDH-CET活性。
　　利用酵母双杂交筛选NdhO与构成NDH-1M的14个亚基之间的相互作用，结果表明NdhO仅与NdhI和NdhK两个亚基之间存在较强的相互作用；并且NdhI与NdhK之间也存在相互作用。而且，随着加入NdhO的不断增加，NdhI与NdhK之间的相互作用逐渐减弱。因此，NdhO位于NdhI与NdhK之间并阻碍了两者之间的相互作用，导致NDH-1M的稳定性降低，从而抑制NDH-CET的活性。
　　将WT从生长光转移到高光的过程中，细胞内NdhI和NdhK的表达显著上调，而NdhO的表达不变。在高光胁迫下，NdhO相对化学计量的降低减少了对NdhI与NdhK之间相互作用的阻碍，提高了NDH-1M的稳定性及NDH-CET的活性。这表明在高光下，蓝藻细胞通过NdhO负调控NDH-CET的机制提高NDH-CET活性，从而有效抵抗高光胁迫。
　　另一方面，为了揭示蓝藻NDH-CET在高温胁迫下的生理功能，我们利用集胞藻6803的NDH-CET削弱突变体ΔndhS展开了以下实验。在高温胁迫下，ΔndhS表现出生长缓慢的表型。通过叶绿素荧光分析发现，随着热胁迫处理时间的延长，WT的NDH-CET活性受到高温诱导逐渐增加；但高温诱导后，ΔndhS的NDH-CET活性未增加。这说明NDH-CET对热胁迫有响应，参与热胁迫下的光保护。
　　利用蓝绿温和凝胶电泳和蛋白免疫印迹方法对WT和ΔndhS类囊体膜上主要光合复合体的积累进行分析，与WT相比，高温处理导致ΔndhS中光合复合体均有所减少，光系统II（PSII）的减少尤为明显；而正常生长温度下，ΔndhS和WT中光合复合体的积累无差异。同样地，正常生长温度下，ΔndhS和WT中PSII和PSI的活性类似；而热胁迫处理后，与WT相比，ΔndhS的PSII和PSI的活性均降低，PSII活性的降低更加明显。以上结果表明热胁迫下NDH-CET的缺失主要导致PSII受到损伤和活性降低。
　　高温胁迫下，与WT相比，ΔndhS的 FV/FM活性显著降低；而加入抑制PSII修复的蛋白合成抑制剂林肯霉素后，WT和ΔndhS的FV/FM活性降低程度相似。这说明NDH-CET的缺失影响PSII的修复过程。热胁迫后，ΔndhS中D1蛋白的表达明显低于WT中D1蛋白的表达；加入林肯霉素后，WT与ΔndhS中均基本检测不到D1蛋白。以上结果进一步肯定了热胁迫下NDH-CET的缺失影响了PSII的修复，从而加剧了PSII的损伤。高温胁迫下NDH-CET可能通过产生跨膜质子梯度及额外ATP，参与修复损伤的PSII和保护PSII活性。
　　综上所述，我们鉴定到了一个负调控NDH-CET的蛋白NdhO，并揭示了NdhO作用的分子机理。这是NDH-CET的分子调控机制方面的首次报道。这一机制可以用于解释蓝藻细胞在各种胁迫条件下如何调控NDH-CET活性，以更好地适应各种胁迫环境得以存活。其次，NDH-CET对蓝藻细胞抵抗热胁迫是必需的。在热胁迫下，NDH-CET活性的增加促进损伤的PSII修复，有利于细胞抵抗热胁迫。以上研究成果加深了人们对蓝藻 NDH-CET的分子调控机制和在高温胁迫下生理功能的了解。

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第1章 循环电子传递研究现状

1.1 引言：光合电子传递链

1.2 循环电子传递的发现

1.3 两条不同循环电子传递途径的鉴定

1.4 循环电子传递的功能

1.5 循环电子传递的分子组分

1.6 不同物种中CET的分布及重要性

1.7 展望

1.8 本研究的目的及意义

第2章 高光胁迫下NDH-CET活性的负调控分子机制

2.1 引言

2.2 实验材料与方法

2.3 实验结果

2.5 本章小结

第3章 NDH-CET在热胁迫下的生理功能

3.1 引言

3.2 实验材料与方法

3.3 实验结果

3.5 本章小结

第4章 讨论与展望

4.1 讨论

4.2 展望

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

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