谷子自噬相关基因SiATG8a调控植物低氮胁迫响应的功能分析

摘要

氮素供应影响植物正常生长发育，开花，衰老，光合作用以及光合作用产物分配等过程。目前，中国在农业生产中氮肥使用量很高，但是氮肥利用率却很低，一方面造成肥料浪费，一方面造成水体富营养化等环境问题。研究植物氮素代谢及转运信号途径，提高肥料利用效率对农业生产非常重要。自噬是一种在所有真核生物进化中高度保守的细胞组分降解过程。当细胞遇到营养缺乏，衰老及其他环境胁迫时，自噬过程在调控细胞组分降解及氮素循环利用方面起重要作用。
　　谷子(Setaria italica)起源于中国，同时具有抗旱及耐瘠薄特点，谷子已成为研究单子叶植物非生物胁迫耐受性的理想材料。目前，谷子全基因组测序已成功完成，但关于谷子非生物胁迫相关基因功能及作用机制的研究仍然很少。
　　本研究在全基因组水平上筛选鉴定谷子自噬基因家族成员，并对该家族成员特性及表达谱进行分析。经过筛选，发现自噬相关基因SiATG8a在谷子低氮条件下表达量较高。本研究对SiATG8a的特性及功能进行进一步分析。同时，为了进一步研究SiATG8a的作用机制，筛选SiATG8a在拟南芥中的同源蛋白AtATG8a的互作蛋白，为阐明自噬作用调控植物低氮胁迫的响应机制创造条件。取得实验结果如下:
　　1.通过谷子全基因组分析，谷子基因组中共鉴定出37个自噬相关基因。基因重复分析表明，片段重复和串联重复事件在谷子自噬相关基因ATG家族扩张过程中发挥重要作用。谷子与水稻共线性分析显示出两个物种中多数ATG基因定位在相似的共线区域内，说明自噬基因在两个物种中拥有共同的祖先。
　　2.基因表达分析揭示共有31个谷子自噬相关基因表达受一个或多个植物激素诱导，26个基因受干旱，盐和冷诱导，24个基因受黑暗条件诱导表达，25个基因受氮饥饿诱导表达。qRT-PCR结果表明，在氮饥饿处理24h后，37个自噬基因中SiATG8a表达量最高，说明该基因在谷子氮饥饿耐受性响应方面发挥重要作用。
　　3.谷子自噬相关基因SiATG8a全长360bp，编码119个氨基酸。亚细胞定位结果显示出SiATG8a定位在细胞膜和细胞质。SiATG8a基因在氮饥饿胁迫下表达升高，且随着处理时间增加表达量也随之升高，在第6天时表达水平达到最高值。
　　4.在水稻中过表达SiATG8a，构建植物表达载体pMWB014:SiATG8a，利用农杆菌侵染方法获得转基因水稻，通过PCR及qRT-PCR分析表明，SiATG8a在转基冈植株中可以稳定遗传并且正常表达。检测转基因水稻中18个自身自噬相关基因的表达，结果表明，SiATG8a基因的插入并没有影响水稻内源自噬相关基因的表达。基因功能分析结果显示，在氮饥饿处理条件下，SiATG8a转基因水稻长势，存活率，株高，鲜重以及根系表面积等均显著高于受体水稻;SiATG8a转基因水稻体内总蛋白含量明显减少，地上部分氮含量高于野生型。以上结果说明，SiATG8a基因表达可以明显提高转基因水稻在氮饥饿胁迫下的耐受性，促进自身体内氮素再循环作用加强。
　　5.在拟南芥中过表达SiATG8a，构建植物表达载体pCAMBIA1302:SiATG8a，通过遗传转化方法获得转基因拟南芥。基因功能分析结果显示，氮饥饿条件下，与野生型拟南芥(WT)相比，SiATG8a转基因拟南芥对氮饥饿不敏感，且生长不受抑制。SiATG8a转基因植物侧根数，叶片总面积和根系总面积均高于野生型拟南芥。同时，SiATG8a转基因植株比野生型拟南芥总氮含量更高，总蛋白含量显著下降。以上结果表明，谷子自噬相关基因SiATG8a能显著提高转基因拟南芥对氮饥饿的耐受性。这一结果与转基因水稻功能验证结果一致，说明SiATG8a在单子叶及双子叶植物中都可以显著提高植物对低氮胁迫的耐性，具有重要的利用价值。
　　6.以SiATG8a拟南芥同源蛋白AtATG8a为诱饵，利用泛素分离系统筛选互作蛋白，通过鉴定发现G蛋白α亚基，AtGPA1可以与AtATG8a互作。通过双分子荧光互补试验(BiFC)证明，AtGPA1与AtATG8a在细胞膜上互作。植物细胞内含物的含量可以间接反应植物自噬过程强弱。通过透射电镜观察拟南芥叶片内含物含量，初步推测AtGPA1突变后影响植物自噬过程。
　　总之，通过对谷子基因组自噬相关基因进行系统分析筛选获得SiATG8a基因，基因功能分析显示，SiATG8a可以显著提高水稻及拟南芥对低氮胁迫的耐性，具有重要的应用价值。初步分析了，iATG8a拟南芥同源基因AtATG8a调控植物自噬过程的作用机制。

目录

摘要

第1章 绪论

1．1 植物氮素营养概述

1．1．1 生物中氮的重要作用

1．1．2 提高植物氮利用效率的研究

1．2 植物细胞自噬研究进展

1．2．1 植物细胞自噬的分子机制

1．2．2 植物细胞自噬与环境胁迫

1．3 异源三聚体G蛋白组成及调控

1．4 谷子的研究进展

1．5 研究目的和意义

1．6 技术路线

2．1 引言

2．2 实验材料

2．2．1 植物材料

2．2．2 实验试剂

2．2．3 培养基组分

2．2．4 实验引物

2．3 实验方法

2．3．1 谷子自噬基因家族检索

2．3．2 谷子自噬基因家族染色体分布及结构分析

2．3．3 谷子自噬基因属性分析

2．3．4 谷子自噬家族蛋白序列比对及进化树构建

2．3．5 谷子自噬基因串联复制，Ka／Ks值，与水稻共线性分析

2．3．6 谷子材料培养条件及胁迫处理

2．3．7 植物总RNA提取，实时定量PCR

2．4 实验结果

2．4．1 自噬基因家族分析及染色体定位

2．4．2 谷子自噬基因进化分析及基因结构

2．4．3 谷子与水稻ATG基因共线性分析

2．4．4 谷子ATG基因复制与扩张度

2．4．5 谷子ATG基因在不同组织中表达分析

2．4．6 谷子ATG基因在不同胁迫处理下的表达谱分析

2．5 本章小结

3．1 引言

3．2 实验材料

3．2．1 植物材料

3．2．2 实验菌株及载体

3．2．3 实验试剂

3．2．4 引物及测序

3．3 实验方法

3．3．1 谷子自噬基因SiATG8a的克隆

3．3．2 植物表达载体构建

3．3．3 蛋白亚细胞定位

3．3．4 水稻遗传转化

3．3．5 转基因水稻的分子生物学检测

3．3．6 转基因水稻氮饥饿胁迫

3．3．7 植物总氮及蛋白含量的测定

3．4 实验结果

3．4．1 谷子自噬基因SiATG8a的克隆

3．4．2 SiATG8a进化分析

3．4．3 SiATG8a基因表达分析

3．4．4 SiATG8a亚细胞定位

3．4．5 表达载体pMWB014：SiATG8a的构建

3．4．6 转基因水稻的获得

3．4．7 转基因水稻的检测

3．4．8 转SiATG8a基因水稻对氮饥饿有耐受性

3．5 本章小结

第4章 SiATG8a在拟南芥中功能及调控机制的分析

4．1 引言

4．2 实验材料

4．2．1 植物材料及cDNA文库

4．2．2 实验菌株及载体

4．2．3 实验试剂

4．2．4 引物及测序

4．3 实验方法

4．3．1 载体构建及转基因拟南芥的获得

4．3．2 转基因拟南芥对氮的响应

4．3．3 泛素分离系统筛选文库

4．3．4 蛋白互作验证

4．3．5 突变体检测

4．3．6 透射电镜观察亚显微结构

4．4 实验结果

4．4．1 SiATG8a提高转基因拟南芥对氮饥饿的耐受性

4．4．2 泛素分离系统筛选文库

4．4．3 AtATG8a与AtGPA1互作验证

4．4．4 纯合突变体鉴定

4．4．5 G蛋白α亚基影响植物自噬途径

4．5 本章小结

第5章 讨论

5．1 谷子自噬基因家族及进化分析

5．2 谷子自噬基因的表达分析

5．3 SiATG8a对氮素利用的调控

5．4 论文创新点

结论

参考文献

攻读博士学位期间所发表的学术论文

声明

致谢