紫花苜蓿(Medicago sativa)缺铁相关bHLH转录因子的克隆及遗传转化

摘要

铁是植物生命活动必需的微量元素之一，土壤中有效铁含量较低，易导致植物缺铁。bHLH转录因子家族在植物体内发挥重要的调控作用，有bHLH转录因子参与植物缺铁响应。本研究从紫花苜蓿中克隆得到MsbHLH115基因，构建pBI121-MsbHLH115植物表达载体转入烟草中，并对MsbHLH115基因的表达模式进行了初步研究，取得的主要研究结果如下: 1.MsbHLH115基因的克隆与序列分析 根据紫花苜蓿铁胁迫下转录组测序序列设计克隆引物，利用RT-PCR方法克隆获得MsbHLH115基因，该基因全长为780bp，编码259个氨基酸。MsbHLH115蛋白含有一个HLH结构域。经NCBI protein BLAST分析，发现MsbHLH115与MtbHLH115氨基酸相似性为96％。通过对MsbHLH115氨基酸序列的预测和生物信息学分析，构建了三级结构模型和系统进化树。 2.MsbHLH115植物表达载体构建 构建了pBI121-MsbHLH115植物表达载体，含有Ca MV35S启动子和卡那霉素(Km)抗性。 3.MsbHLH115基因对烟草的遗传转化 将pBI121-MsbHLH115重组质粒转入到GV3101感受态中，利用叶盘法将MsbHLH115转化至模式植物烟草中，PCR鉴定获得2株转基因阳性苗。 4.MsbHLH115基因的表达特性 qRT-PCR检测了MsbHLH115基因在不同非生物胁迫下的紫花苜蓿中的相对表达量。发现MsbHLH115基因受高铁缺铁胁迫强烈诱导表达，主要的表达部位是根部，茎、叶中表达量极低;MsbHLH115基因响应盐胁迫下调表达、响应碱和干旱胁迫上调表达，响应ABA上调表达，不响应茉莉酸甲酯。

目录

摘要

第1章绪论

1．1紫花苜蓿简介

1．2铁的重要性

1．3 bHLH转录因子

1．3．1 bHLH转录因子的结构

1．3．2植物bHLH转录因子的生物学功能

1．3．3植物缺铁应答的bHLH转录因子

1．4．植物bHLH转录因子参与其他胁迫响应

1．5本课题的研究目的和意义

第2章紫花苜蓿(Medicago sativa)bHLH基因的克隆

2．1引言

2．2实验材料

2．2．1植物材料

2．2．2载体和菌株

2．2．3主要仪器设备

2．2．4主要试剂

2．3实验方法

2．3．1紫花苜蓿总RNA提取

2．3．2 cDNA的合成

2．3．3 PCR扩增目的基因

2．3．4基因片段的胶回收

2．3．5 MsbHLH115基因克隆载体的构建

2．3．6 MsbHLH115基因的生物信息学分析

2．4实验结果

2．4．2 MsbHLH115克隆载体的构建

2．4．3MsbHLH115基因的生物信息学分析

2．5本章讨论

2．6本章小结

第3章MsbHLH115基因对烟草的遗传转化

3．1引言

3．2实验材料

3．2．1植物材料

3．2．2质粒载体与菌株

3．2．3实验药品及仪器

3．3实验方法

3．3．1 pBI121-MsbHLH115植物表达载体的构建

3．3．2 pBI121-MsbHLH115质粒转化农杆菌

3．3．3烟草的遗传转化

3．3．4转MsbHLH115基因烟草的分子鉴定

3．4实验结果

3．4．2 pBI121-MsbHLH115转化农杆菌

3．4．3MsbHLH115基因对烟草的遗传转化

3．4．4转基因烟草的PCR检测

3．5本章讨论

3．6本章小结

第4章紫花苜蓿MsbHLH115基因在逆境胁迫下的表达模式分析

4．1引言

4．2．实验材料与药品

4．2．1实验材料与试剂

4．3实验方法

4．3．1 MsbHLH115启动子序列的获取及分析

4．3．2紫花苜蓿材料的培养和前期处理

4．3．3紫花苜蓿MsbHLH115基因qRT-PCR检测

4．4结果与分析

4．4．1 MsbHLH115基因启动子顺式作用元件分析

4．4．2 RNA、cDNA质量检测

4．4．3MsbHLH115基因胁迫下的表达模式分析

4．5本章讨论

4．6本章小结

结论

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文

声明

致谢