发酵产氢新菌种及纯培养生物制氢工艺研究

摘要

能源对于人类生存、经济繁荣及社会发展是至关重要的。氢气作为清洁和可再生的能源己逐渐被人类所接受。任南琪教授开发的混合培养发酵法生物制氢技术为解决能源与环境问题提供了重要的技术选择。然而，为拓宽生物制氢的微生物种质资源及其产业化应用，还需要调查混合培养的活性污泥中的微生物多样性，分离培养出高效产氢特定微生物菌种，研究这些产氢细菌的种属分类地位和产氢特性，进一步应用于纯培养制氢工程。 本文首先调查了混合培养系统中的乙醇型发酵稳定产氢的微生物多样性，对产氢细菌培养基进行简化，重新配制HPB-LR培养基，建立平板培养瓶法(PCBM)厌氧技术和改良Hungater滚管法，从混合培养系统污泥中分离培养出270株纯培养物；采用气相色谱仪器分析这些菌株的液相末端产物的组成、数量和相互间的比值，判断细菌的发酵类型，进而将分离的菌株划分为12种生化类型；对其中不同类型的8株菌进行16SrDNA碱基测序和系统发育学分析，发现均为新菌种，其中4株属于新型厌氧产氢菌，1株属于梭菌属厌氧产氢菌，1株属于丙酸杆菌属，1株属于乳酸菌属，1株属于克雷伯氏菌属。对产氢效率较高的新型厌氧产氢菌株Rennanqilyf3(简写为R3)和Rennanqilyf12(简写为R12)进行了生理生化鉴定、16SrDNA和16S-23SrDNA间隔区的碱基测序等分子生物学和系统发育学分析，表明R3和R12分别是2个独立的种。菌株R3的16SrDNA和最长16S-23SrDNA间隔区的碱基分别为1525bp和1262bp，NCBI的登录号分别为AY363375和AY365107菌株R12的16SrDNA为1506bp，NCBI的登录号为AY332392。 利用间歇培养试验研究了发酵产氢新菌种R3的产氢能力及其调控方法。菌株R3在葡萄糖浓度为12.0g/L时，产氢量最大；葡萄糖浓度为15.0g/L时，细胞生长量最大。与无机氮源相比，有机氮源氢气产量较高，而酵母粉是R3氢气生产和细胞生长的最有效的有机氮源。微生物生长和产氢起始发酵液的最佳pH值为5.5左右，培养温度在30～35℃之间为宜。碳酸盐对菌株R3的产氢量和生物气中氢气的含量有不利影响，磷酸盐对产氢量有明显的促进作用，缓冲液K2HPO4-KH2PO4的浓度为0.15mol时较适宜。当发酵液的碳氮质量比(C/N)为3.3时，葡萄糖利用率最高，生物气体产量和氢气产量最大；碳源类型对菌株的氢气产量和含量也有具有较大的影响，六碳糖和双糖产氢量和氢气含量比五碳糖高。 分批培养(平均产氢速率高)、补料分批培养(产氢量高)和连续培养(比产氢率高)纯培养生物制氢工艺因各自的产氢优势，可以应用于生物制氢工程中，发酵产氢新菌种R3能够成为纯培养工艺应用的工程菌。 纯培养生物制氢工艺的主要工程控制对策为：按反应溶液体积的2％接种新鲜产氢细菌种子培养液，底物浓度采用10％～15％，反应启动时间15-17h，温度35℃，pH4～4.5，启动阶段溶解氧达到10％左右；在补料分批培养过程中，补料时间按发酵产氢量来确定，当产氢量下降到0.2ml/h时，进行补料和排液操作，流加量应为培养液总量的40％。 综合分析国内外具有最高产氢能力的几株产氢细菌，发现菌株R3具有迄今为止发现的菌株中最高的最大产氢速率为35.74mmolH2/gcelldryweight(CDW).h；较高的比产氢率为2.43molH2/mol葡萄糖；具有产业化应用的前景。

目录

文摘

英文文摘

第1章绪论

1.1概论

1.2发酵法生物制氢细菌学研究现状

1.2.1产氢细菌的分离条件和方法

1.2.2产氢细菌的鉴定

1.2.3发酵产氢菌种的产氢效能

1.2.4发酵产氢菌种产氢能力的调控和底物利用

1.2.5产氢细菌应用技术

1.3发酵法生物制氢工艺研究现状

1.3.1生物制氢工艺概述

1.3.2混合培养发酵法生物制氢工艺

1.3.3纯培养发酵法生物制氢工艺

1.4本课题研究目的意义与内容

1.4.1课题来源

1.4.2本课题研究目的和意义

1.4.3主要研究内容

第2章试验装置、材料与方法

2.1试验装置

2.1.1连续流混合培养试验装置

2.1.2间歇培养试验装置

2.1.3厌氧操作实验装置与技术

2.1.4发酵试验装置

2.2试验仪器与设备

2.3试验材料

2.3.1试验采用的微生物

2.3.2培养基

2.4理化分析项目与方法

2.4.1理化分析项目

2.4.2葡萄糖的测定

2.4.3微生物细胞干重的测定

2.4.4发酵气体中氢气含量的测定

2.4.5液相末端发酵产物的测定

2.5微生物学分析项目与方法

2.5.1细菌形态特征

2.5.2细菌培养特征与生理特征

2.5.3产氢菌碳源利用

2.5.4细菌生化特征

2.6微生物形态学观察

2.6.1光学显微镜下观察法

2.6.2透射电子显微镜观察法

2.6.3原子力显微镜观察法

2.7分子生物学分析项目与方法

2.7.1分子生物学分析项目

2.7.2分子生物学分析方法

第3章发酵产氢菌种分离鉴定及其系统发育学分析

3.1混合培养发酵生物制氢系统的产氢细菌

3.1.1不同产氢系统细菌的发酵产物组成

3.1.2发酵产氢系统细菌的类型与生化多样性

3.1.3发酵产氢系统细菌的遗传多样性

3.2产氢发酵细菌的分离、筛选与鉴定

3.2.1厌氧产氢细菌分离培养技术

3.2.2产氢细菌的筛选

3.2.3产氢细菌的分离

3.3产氢发酵细菌的生理生化特性

3.4产氢发酵细菌的分子生物学特性

3.4.1 DNA片断的RFLP多态性分析

3.4.2 DNA片断的SSCP多态性分析

3.4.3 16S-23S rDNA间隔区(ISR)长度多态性

3.5菌株R3和R12的16S rDNA序列测定与系统发育学分析

3.6本章小结

图

第4章发酵产氢新菌种产氢特性与调控

4.1发酵产氢菌种产氢能力比较

4.2培养条件

4.2.1底物浓度

4.2.2 pH

4.2.3温度

4.2.4碳水化合物

4.2.5生物质

4.3碳氮质量比对菌种R3氢气生产的调控

4.3.1有机氮源的选择

4.3.2无机氮源的选择

4.3.3碳氮质量比

4.4碳酸盐和磷酸盐对菌株R3氢气生产的调控

4.4.1磷酸盐

4.4.2碳酸盐

4.4.3磷酸盐和碳酸盐的选择

4.4.4磷酸盐缓冲液

4.5本章小结

第5章纯培养制氢工艺研究与工程控制对策

5.1分批培养制氢工艺

5.1.1分批培养产氢细菌R3的氢气生产

5.1.2分批培养产氢细菌R3的生长

5.1.3分批培养产氢细菌R3的代谢特征

5.2补料分批培养制氢工艺

5.2.1补料分批培养产氢细菌R3的氢气生产

5.2.2补料分批培养产氢细菌R3的细菌生长

5.2.3补料分批培养产氢细菌R3的代谢特征

5.3连续培养制氢工艺

5.3.1连续培养产氢细菌R3的氢气生产

5.3.2连续培养产氢细菌R3细菌生长、pH值和溶解氧(DO)的变化

5.3.3连续培养产氢细菌R3的代谢特征

5.4菌株R3产氢能力的对比

5.5本章小结

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

论著

国家菌种保藏中心保藏菌种名录

哈尔滨工业大学博士学位论文原创性声明及使用受权书

致谢

个人简历