空间和重离子辐射环境的诱变效应与DNA甲基化变化的关联

摘要

为了探讨空间环境对植物种子产生生物学效应的机制，本论文从多个方面研究了空间飞行后当代水稻表型变化植株和非表型变化植株的表观遗传学效应，包括DNA甲基化多态性改变的程度及序列特征和遗传性，以及DNA甲基化变化与基因表达及基因组突变的关联。同时，通过对地基模拟辐射的研究剖析了空间环境中辐射因素对植物表观遗传学的影响。研究发现无论是空间飞行还是低剂量（2Gy）重离子辐射都能够引起水稻种子DNA甲基化的变化（P<0.05）。这种变化在表型变化植株上的程度明显高于非表型变化植株（P<0.01），而且DNA甲基化的变化更倾向于发生在基因组序列中的CNG位点上。DNA甲基化的多态性变化与基因组序列多态性变化的比较发现二者在变化率上具有相关性（P<0.001），即DNA甲基化变化明显的植株基因组序列变化也明显。序列特征研究表明空间飞行和重离子辐射引起的DNA甲基化变化广泛地分布在水稻基因组上包括基因外显子的区域上，但基因组序列多态性的变化则更倾向于发生在重复序列上。研究还发现部分发生在基因编码区的DNA甲基化和去甲基化变化与基因转录水平的下降或上升相对应。遗传性的分析表明无论是DNA甲基化的变化还是与甲基化变化相对应的基因转录水平的变化都能够遗传至下一代。以上结果说明表观遗传学机制参与了空间环境对植物种子的生物学效应，而且空间复合环境中的辐射因素可能是改变基因组甲基化的主要诱因。由于植物甲基化状态可影响基因表达并能稳定遗传，我们推测空间辐射引起植物种子当代出现表型变化且能稳定遗传的特征可能与基因组甲基化的变化相关。
　　为了进一步研究辐射能够在水稻种子上产生明显表观遗传学效应的机制，本课题分析了种子与幼苗这两个不同发育阶段的水稻材料在相同剂量（2Gy）的重离子辐射后产生DNA甲基化改变的差异。结果发现种子的DNA甲基化变化程度明显高于幼苗（P=0.011）。为进一步分析这种特征与辐射诱因和抗逆生物学活性的关联，我们对比分析了0.02~20Gy剂量的重离子辐射引起水稻干种子、湿种子和幼苗的细胞生物学和抗氧化应激系统改变的特征。研究结果显示，当剂量小于2Gy时辐射能够对植物的生长产生刺激作用，而当剂量大于2Gy时则开始出现明显的抑制作用。三种不同时期水稻材料的比较发现低剂量辐射的生物学刺激效应和植物材料的含水量有关。染色体畸变的观察显示在三种水稻材料中染色体的畸变率都随着辐射剂量的增加而增加。但是，在较低剂量下（小于2Gy）水稻种子的染色体损伤要多于幼苗。丙二醛（MDA）的含量检测和两种抗氧化酶：超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的活力检测结果表明，较低剂量（小于2Gy）辐射后，种子中的抗氧化酶的活力低于幼苗，MDA的含量高于幼苗；当辐射剂量大于2Gy时，幼苗中出现显著的抗氧化酶SOD和CAT活力下降和相应的MDA含量升高，与此同时染色体损伤也明显增加，存活率下降。这一结果说明低剂量的辐射生物学效应不但与辐射因素相关，还与生物体的抗氧化应激状态有非常重要的关联。抗氧化系统不能有效地激活很可能是种子对低剂量重离子辐射的敏感性高于幼苗的主要原因。

目录

空间和重离子辐射环境的诱变效应与DNA甲基化变化的关联

RELATIONSHIP BETWEEN SPACE OR HEAVY ION RADIATION ENVIRONMENT INDUCED MUTAGENIC EFFECTS AND DNA METHYLATION ALTERATIONS

摘 要

Abstract

目 录

Contents

第1章 绪论

1.1 空间环境及其诱变效应简介

1.1.1 空间辐射环境

1.1.2 航天器内辐射环境

1.1.3 空间辐射诱变效应的机制

1.2 辐射生物效应

1.2.1 辐射生物学效应机制

1.2.2 辐射对植物的影响

1.2.3 辐射对植物种子的影响

1.3 空间飞行的生物学效应

1.3.1 空间飞行对动物细胞的影响

1.3.2 空间飞行对植物及其种子的影响

1.3.3 空间辐射生物效应机制研究的关键问题

1.4 DNA甲基化与辐射生物学效应

1.4.1 表观遗传学与DNA甲基化简介

1.4.2 哺乳动物中的DNA甲基化的特点

1.4.3 植物中的DNA甲基化的特点

1.4.4 DNA甲基化的生物学功能

1.4.5 环境变化对DNA甲基化的影响

1.4.6 辐射对动植物DNA甲基化的影响

1.4.7 DNA甲基化的调节方式

1.4.8 DNA甲基化的研究方法

1.5 本课题研究的目的和意义

第2章 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 水稻材料的处理

2.1.2水稻材料的培养

2.2 主要仪器设备及试剂

2.2.1 仪器设备

2.2.2 酶及试剂

2.2.3 溶液与培养基

2.3 实验方法

2.3.1 根尖染色体观察

2.3.2 抗氧化检测

2.3.3 DNA甲基化检测

2.3.4 AFLP法分析基因组多态性

2.3.5 差异条带的回收与纯化

2.3.6 克隆测序

2.3.7 RT-PCR

第3章 空间飞行对水稻基因组DNA甲基化的影响

3.1 HPLC法分析水稻基因组甲基化水平的变化

3.2 MSAP法分析CCGG位点甲基化水平的变化

3.2.1 MSAP法检测基因组CCGG位点甲基化变化的类型分析

3.2.2 空间飞行对水稻基因组CCGG序列甲基化状态的影响

3.3 甲基化变化序列的测定和特定位点甲基化变化分析

3.3.1 甲基化变化位点的序列分析

3.3.2 胞嘧啶/脱氧胞嘧啶脱氨基酶基因甲基化变化分析

3.4 DNA甲基化状态改变的遗传特性分析

3.5 讨论

3.6 本章小结

第4章 模拟空间辐射对水稻DNA甲基化影响的特征

4.1 HPLC法分析水稻基因组甲基化水平的变化

4.2 MSAP法分析水稻基因组CCGG序列甲基化的变化

4.3 DNA甲基化变化位点序列分析

4.4 DNA甲基化状态改变的遗传特性分析

4.5 讨论

4.6 本章小结

第5章 空间辐射对基因组序列和甲基化影响的关联

5.1 空间飞行引起基因组变化和DNA甲基化变化的关系

5.1.1 空间飞行引起水稻基因组序列多态性的变化

5.1.2 空间飞行引起水稻基因组序列变化位点的分析

5.1.3 空间飞行引起基因组变化和DNA甲基化变化的关系

5.2 重离子辐射引起基因组变化和DNA甲基化变化的关系

5.2.1 重离子辐射引起水稻基因组多态性的变化

5.2.2 重离子辐射引起水稻基因组序列变化位点的分析

5.2.3 重离子辐射引起基因组变化和DNA甲基化变化的关系

5.3 讨论

5.4 本章小结

第6章 DNA甲基化变化与基因表达的关联

6.1 空间飞行和重离子辐射对水稻编码区DNA甲基化的影响

6.2 空间飞行和重离子辐射引起水稻蛋白表达的变化

6.2.1 编码区DNA甲基化变化与蛋白表达的关系

6.2.2 空间飞行和重离子辐射引起水稻蛋白组表达谱的变化

6.3 讨论

6.4 本章小结

第7章 水稻种子的低剂量辐射生物学效应特征

7.1 重离子辐射对水稻种子和幼苗的表观遗传学效应

7.1.1 水稻材料的辐射处理

7.1.2 重离子辐射对水稻种子和幼苗DNA甲基化的影响

7.2 重离子辐射对水稻种子和幼苗的细胞生物学效应

7.2.1 水稻材料的辐射处理

7.2.2 重离子辐射对水稻存活率的影响

7.2.3 重离子辐射对水稻根长的影响

7.2.4 重离子辐射对水稻根尖有丝分裂指数的影响

7.2.5 重离子辐射对水稻根尖间期细胞的影响

7.2.6 重离子辐射对水稻根尖有丝分裂细胞的影响

7.3 重离子辐射对不同时期水稻材料抗氧化系统的影响

7.3.1丙二醛（MDA）含量的检测

7.3.2 超氧化物歧化酶（SOD）活力检测

7.3.3 过氧化氢酶（CAT）活力检测

7.4 讨论

7.4.1 重离子辐射对水稻种子和幼苗的表观遗传学效应

7.4.2 重离子辐射对水稻种子和幼苗的细胞生物学效应

7.4.3 重离子辐射对水稻种子和幼苗抗氧化系统的影响

7.5 本章小结

结 论

参考文献

附录 测序结果

攻读博士学位期间发表的论文

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致 谢

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