不同生态环境下氨氧化古细菌的种群分布和生长特性研究

摘要

氨氧化作用是自然生态系统氮循环和氨氮污染防治的关键过程和限速步骤。近年来,随着对氨氧化古细菌(AOA)研究的不断深入,人们已经在多种极端环境(高温温泉、高盐湖泊、深海等)和普通环境(土壤、河流、湖水及其沉积物等)中发现了它的存在。目前,有关AOA的研究主要集中于调查其在某一类生态环境中的分布特征,而对同一区域多种复杂环境中AOA的数量和种类分布研究则相对较少,对不同培养条件下氨氧化菌群的数量变化情况也未作深入研究。本课题将对此内容展开系统研究,并在AOA的分离筛选方面做出探索性尝试。
　　通过文献调研和实地考察,确定了以深圳及其周边不同自然生态环境和污水处理系统为研究对象,利用荧光定量PCR技术分析氨氧化古细菌和氨氧化真细菌(AOB)之间的数量关系,采用DGGE技术和克隆文库法研究AOA的群落结构特征。然后采用不同培养条件对原位样品进行富集培养,考察在普通富集培养基和抗生素培养基中氨氧化菌群性能和数量变化情况。最后采用平板分离技术对AOA的分离和纯培养进行探索性尝试,并采用分子生物学技术进行初步鉴定。
　　本研究得到主要研究成果如下:
　　(1)在土壤、水体及其沉积物等环境中,AOA的amoA基因拷贝数明显多于AOB,二者比例在3.75～14.1之间。在污水处理系统好氧池中,AOA的amoA基因拷贝数则远远小于AOB,前者仅为后者的10-2～10-4。
　　(2)DGGE实验结果表明,amoA基因更适合作为AOA表征的标志。生态类型的差异对AOA的种群多样性影响较大,而在同一种生态环境类型中,水体和沉积物类型间的差异对AOA的种群结构影响较小。
　　(3)克隆文库法共检测出了13种不同的OTU(分类操作单元)。其中湖水和河水环境中的优势种群都是OTU-1和OTU-2,土壤环境中的优势种群为OTU-9,海洋系统中的优势种群则为OTU-8和OTU-5。生态环境中AOA多样性指数最高的为海洋生态系统,最低的为湖水生态系统。
　　(4)富集菌液在较低氨氮、较高溶解氧浓度的培养条件下,对培养基中氨氧的利用率都不超过15％,富集菌液中AOA的数量明显低于AOB。富集菌液在链霉素浓度为25μg/mL的抗生素培养基中培养4周后,菌液中AOA数量明显占优,数量可达AOB的20～30倍。
　　(5)利用链霉素分离培养基对环境样品进行长时间的富集培养,从温泉中获得所占比例可达99.9%,种群类型单一的AOA富集菌液。该菌在分类地位上属于Uncultured crenarchaeote,和某高温温泉中检测到的DESP amoA-125基因同源性在99%以上，具有重要的理论研究和应用价值。

目录

不同生态环境下氨氧化古细菌的种群分布和 生长特性研究

RESEARCH ON COMMUNITY DISTRIBUTION AND GROWTH CHARACTERISTICS OF AMMONIA-OXIDIZING ARCHAEA IN DIFFERENT ENVIRONMENTS

摘 要

Abstract

第1章 绪 论

1.1 课题背景

氮循环中的氨氧化作用研究

氨氧化菌群的分类及其机制研究

1.2 氨氧化古细菌的研究进展

氨氧化古细菌的系统发育和功能基因研究进展

上同生态系统中氨氧化古细菌分布

影响氨氧化古细菌种群分布的影响因子

1.3 氨氧化古细菌的分子生态学分析方法进展

变性梯度凝胶电泳（DGGE）和温度梯度凝胶电泳（TGGE）

单链构象多态性分析（SSCP）

末端限制性片段长度多态性（T-RFLP）

扩增的rDNA限制酶切分析技术（ARDRA）

荧光原位杂交技术（FISH和CARD-FISH）

克隆文库构建技术（Clone Library）

实时荧光定量PCR（Real-time PCR）

1.4 未可培养微生物的培养技术

稀释培养技术

模拟自然培养技术

混合培养技术

氨氧化古细菌的培养和分离技术

1.5 课题研究的目的意义

1.6 课题的技术路线和主要研究内容

技术路线

主要研究内容

第2章 不同环境样品的采集和总DNA的提取

2.1 引言

2.2 实验材料

采样区域位置和地理概况

供试样品

主要试剂和培养基

主要仪器

2.3 实验方法

常规分析项目与方法

上同生态环境和污水系统样品的采集

上同环境样品的氨氧化性能考察

环境样品总DNA的提取及纯化

2.4 结果和讨论

上同环境样品基本理化性质分析

上同环境样品的氨氧化性能情况

环境样品总DNA的提取

2.5 本章小结

第3章 不同环境中AOA和AOB的数量分布研究

3.1 引言

3.2 实验材料

主要分子生物学试剂

主要仪器

3.3 实验方法

环境样品DNA的PCR扩增

定量PCR标准质粒的制备

荧光定量PCR实验及分析

3.4 结果和讨论

AOA和AOB的amoA基因的PCR扩增及克隆鉴定

AOA和AOB的amoA基因质粒的标准曲线绘制

上同环境中AOA和AOB的数量关系

环境理化因子和氨氧化菌群数量的相关性分析

3.5 本章小结

第4章 不同环境中氨氧化古细菌的种群结构的研究

4.1 引言

4.2 实验材料

供试样品与试剂

主要仪器

4.3 实验方法

环境样品总DNA的提取和纯化

氨氧化古细菌的amoA基因片段的PCR扩增

变性梯度凝胶电泳

DGGE图谱与多样性分析

AOA的克隆文库的构建

AOA系统发育树的构建与分析

4.4 结果和讨论

利用上同引物扩增AOA的amoA基因的电泳图谱

AOA的amoA基因PCR-DGGE图谱分析

AOA的DGGE特征条带聚类分析

AOA的amoA基因克隆文库的构建与分析

AOA的系统发育结果分析

氨氧化菌群特性的相关性分析

4.5 本章小结

第5章 富集样品中氨氧化菌群性能和数量变化研究

5.1 引言

5.2 实验材料

主要试剂和培养基

主要仪器

5.3 实验方法

富集培养样品的氨氧化性能考察

添加抗生素的培养基中氨氧化性能考察

上同培养条件下AOA和AOB的数量测定

5.4 结果和讨论

富集样品的氨氧化性能分析

富集样品中AOA和AOB的数量关系

富集菌液在添加抗生素培养基中的氨氧化性能

链霉素富集培养基中AOA和AOB的数量关系

5.5 本章小结

第6章 对氨氧化古细菌分离纯化的初步探索

6.1 引言

6.2 实验材料

主要试剂和培养基

主要仪器

6.3 实验方法

样品的富集和筛选

氨氧化古细菌的分离和纯化

菌落的形态观察

分子生物学初步鉴定

6.4 结果和讨论

常温条件下氨氧化菌群的富集培养

氨氧化古细菌的平板分离初探

高温条件下氨氧化古细菌的富集与分离

对氨氧化古细菌富集培养和纯种分离的建议

6.5 本章小结

结 论

参考文献

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致 谢