外燥致病机制的实验研究

摘要

本研究的理论基础及指导思想“秋伤于燥”、“燥气先伤于华盖”、“燥胜则干”等经典理论均指出燥邪特点其形成与时令有关。后世论燥，或描其象，或述其性，其文又散在于少数名家精选病案之中，宏观的理论框架与缺乏系统的科学依据对其病因病机的精细阐析，成为对六淫之燥邪病因病机研究的重点问题之一。查阅近30年国内外文献资料，未见对外燥致病机理的系统实验研究和对温燥与凉燥“温度-湿度”空间量化指标的研究报道。如何运用多学科的现代科学理论与技术，模拟符合中医六淫病因理论中关于外燥之温度、湿度等空间量化指标，在此基础上探索建立外燥动物模型和开展更深入的研究，更是外燥病因病机研究中的“敏感性”课题之一。完整地模拟某个季节气候及变化以研究与疾病的关系是困难的，选择一个较小的时间段如一个季节，结合多学科理论与技术，是研究时令性疾病的有效途径之一。 本课题在《内经》“天人相应”指导下，遵循《内经》外燥致病的理论和后世名家思想与学说，在对外燥病邪进行理论回顾的基础上，根据气象学中“候平均气温”、“季平均温度”，拟以具有典型大陆气候特征的华中地区的郑州秋季之平均温度和相对湿度，结合现代免疫学、医学微生物学、分子生物学、血液流变学、组织病理学等理论与技术，首次模拟六淫燥邪之温燥与凉燥的“温度-湿度”量化空间并筛选相应指标，探索初步建立外燥小鼠模型；以检测“肺系”生理功能为主要切入点，选择反映外燥对“肺系”生理功能影响的相关指标，开展呼吸道液黏多糖与“肺津生成”、气道纤毛运动试验与“纤毛-黏液毯”生物防御屏障与气道免疫功能、血液流变学与“津血同源”及“燥胜则干”、气道细胞凋亡与bcl-2、bax基因表达、对细菌攻击的敏感性、气管、肺与皮肤病理组织学，以及经典方剂对温燥与凉燥的治疗效应等综合性研究，旨在为阐析外燥伤肺、伤津、“燥胜则干”之病因病机宏观理论框架提供科学实验根据，填补外燥病因病机系统性实验研究的“空白”，丰富六淫燥邪病因理论，为研究治疗秋燥之经典方作用机制提供基础模型和量化检测指标，具有理论创新和临床指导意义。 1材料1.1实验动物：昆明种小鼠(SPF级)，体重18±1g，雌雄各半，湖北省实验动物中心提供，许可证号：SCXK(鄂)2003-2005。 1.2标准细菌菌株：金黄色葡萄球菌(ATCC25923，北京天坛生物制品公司)。 1.3主要仪器：LRH-250人工智能气候箱(温度：30-65℃±1℃，相对湿度：30％-90％±5％，广东医疗器械厂)；MASTER-K30H风扇程控仪(韩国Best机电有限公司)，XSJ-D恒温倒置显微镜(重庆)，紫外分光光度计(756MC，上海精密科学仪器有限公司)，-85℃低温冰箱(VXE380，法国)，酶标检测仪(KHBST-360，上海)，FASCO-全自动血液流变仪(重庆南方医疗设备公司)，细菌菌落计数器(JLQ-S，江苏)，图像分析系统(HPIAS-1000，华中科技大学同济医学院提供)。 1.4主要试剂：咔唑(054K078，Sigma公司)、D-葡萄糖醛酸内酯(2711EC，Sigma公司)、羊抗鼠IgGELISA试剂盒(华美生物工程公司，200501)、TUNEL试剂盒(MK1020)、Bcl-2兔IgG多抗(BA0412，200503)、bax兔IgG多抗(BA0315，200503)、各阳性对照片均购自武汉博士德生物工程有限公司，有效期内使用。 1.5实验药物：桑杏汤/杏苏散组方源自《温病条辨》。生药由湖北省荆州市中药材公司提供，经鉴定系正品。取一剂，加3倍水浸泡2小时后微火煎至100ml、重复3次，取3次煎液过滤混匀并水浴浓缩至200ml，其生药量为0.360g/L。按临床成人用剂量计算，治疗组小鼠按0.009g·kg-1·d-1生药量灌胃处理，1次/天，连用5天。对照组用无菌生理盐水代替药物。 2方法2.1造模条件：将560只昆明种小鼠(SPF级)分为常温常湿组、常温燥组、温燥组、凉燥组，140只/组。分批购进的各组小鼠根据实验设计，分批置于人工气候箱内，用昆明种小鼠颗粒饲料饲养，按表1模拟外燥“温度-相对湿度-风”综合条件刺激造模。 表1各组小鼠“温度-相对湿度-风”处理条件组别温度(℃)相对湿度(RH，％)风速(m/S)处理小时/天(h/d)常温常湿15±270±22.55常温燥15±233±22.55温燥22±233±22.55凉燥8±233±22.552.2实验检测项目：各组于处理后第7天和第14天按文献方法检测以下项目：2.2.1气管、肺、背部皮肤与足垫皮肤组织病理学观察：常规病理组织学方法。 2.2.2气道液黏多糖检测：咔唑比色法。 2.2.3肠道液黏多糖检测：咔唑比色法。 2.2.4气管上皮纤毛运动试验：离体气管纤毛试验法。 2.2.5血清IgG抗体与气道液IgG抗体：酶联免疫吸附试验。 2.2.6血液流变学检测：全自动血液流变学检测法。 2.2.7脾脏与胸腺平均重量测定：常规称重法。 2.2.8粪便含水率测定：剖取结肠粪便称重法。 2.2.9气管上皮细胞凋亡与bcl-2、bax基因表达检测：细胞凋亡用TUNEL法；bcl-2、bax基因表达用免疫组化法。 2.2.10外燥小鼠对细菌攻击敏感性：经鼻接种细菌后常规检测小鼠肺细菌数。 2.2.11桑杏汤对温燥小鼠的治疗效应：检测2.2.2至2.2.8之项目。 2.2.12杏苏散对凉燥小鼠的治疗效应：检测2.2.2至2.2.8之项目。 3统计学处理：实验数据以(x±s)表示，采用SPSS13.0软件，资料之间比较用ANOVA分析，显著性检验采用多个样本均数间q检验(Newman-Keuls法)；各组第7天与第14天比较用t检验，P＜0.05认为差异有统计学意义，检验水准为双侧a=0.05。 3结果3.1组织病理学观察。结果显示，第14天温燥组气管上皮鳞状化生与炎性细胞浸润，气管纤毛倒伏、粘连或片状缺损，≥40％气管黏膜浆液腺上皮黏液腺化生，肺泡充血、水肿；皮肤毛枯色糙、新毛生长受阻、毛球数急骤减少与皮下脂肪增生；足垫皮肤角化层疏松，结缔组织增生与汗腺减少，各项指标均较第7天为重。 上述病理变化与燥伤肺津，宣输失司，更致皮肤失之濡养有关。凉燥组气管上皮鳞状化生、气管纤毛多呈灶状缺损，≥20％气管黏膜浆液腺上皮黏液腺化生，肺部瘀血、水肿；足垫皮肤结缔组织增生与汗腺减少，其机制与凉伤肺阳而致肺津不化、凝成痰饮有关。结果显示外燥致病确有其组织细胞学基础，为“肺主皮毛”之理论提供证据。 3.2外燥对气管纤毛运动与气道液生成的影响。与常温常湿组第7天与第14天相对稳定的气管纤毛运动(17.56±1.96、17.89±1.96)与气道液分泌(513.77±243.67、544.89±227.88)比较，常温燥组第7天气道液分泌略增加，气管纤毛运动加快，至第14天该组气道液分泌减少，同期气管纤毛运动更快(P＜0.01)。温燥组第7天气道液分泌代偿性增加(846.11±287.70)、气管纤毛运动速度加快(13.56±1.74，P＜0.01)；第14天气道液分泌减少(342.22±107.91)、气管纤毛运动减缓(15.75±2.46，P＜0.01)。凉燥组第7天气道液分泌减少、气管纤毛运动加快不明显，但第14天气道液分泌增加、气管纤毛运动加快(P＜0.01)。尽管与外燥相关的三组的气道液分泌与气管纤毛运动值不尽相同，但其趋势是，当气道液分泌增加时，气管纤毛运动加快；当气道液分泌减少时，气管纤毛运动减缓。表明外燥伤肺、耗津之时，因致气道液分泌减少而损伤其对气道“纤毛-黏液毯”生物防御屏障的保护作用。 3.3血液流变学试验。与常温常湿组相比，在温燥组第7天气道液分泌代偿性增高、第14天气道液分泌明显减少，温燥耗伤肺津致血之生成匮源，不仅渗入脉内之津液不足，脉内之津反而渗入脉外，更加重血量不足；该组血浆粘度、低切全血粘度、还原粘度、中切全血粘度、高切全血粘度升高(P＜0.01)；血容量减少时，温燥组同一切变率下全血还原粘度、红细胞聚集指数、红细胞电泳指数增高，显示红细胞聚集性增高；高切变率下全血粘度、红细胞刚性指数增高，红细胞平均血红蛋白浓度增高，表明红细胞变形性减低(P＜0.01)。 3.4抗体水平检测。与常温常湿组第7天与第14天抗体水平相比(6.01±0.74、5.68±0.64)，常温燥组、凉燥组小鼠血清IgG抗体变化无显著性(P＞0.05)，凉燥组气道IgG抗体增高(7.95±0.77，8.82±0.71，P＜0.01)；温燥组第14天血清IgG抗体增高(11.18±1.15)，特点是第7天与第14天气道IgG抗体显著减少并持续低水平(2.13±0.29，2.66±0.77，P＜0.01)，表明温燥伤耗肺、耗津与肺津生成减少之时，弥散入气道的IgG抗体含量随温燥之延长而持续减低。

目录

英文缩略语表

前 言

第一部分理论探讨

第二部分实验研究

结果与讨论

参考文献

附一 一、历代医家对外燥论述摘要

附二 二、外燥病因病机之理论探讨

附三 博士学位期间发表的学术论文

附图

致谢