含羧基类有机物修饰碳基电极的构建及细胞毒性检测研究

摘要

细胞电化学方法凭借其高效简便、绿色无毒及可大规模操作等优点，在体外生物学检测领域中得到了迅速发展。然而传统细胞电化学检测主要采用纳米材料修饰的玻碳电极及毫升规模的检测池进行，在很大程度上提高了检测成本。本论文针对传统检测系统无法满足实现对微量细胞样品敏感测定的需求及电极制备复杂等方面的不足，展开了对有机物修饰碳基电极和微检测系统在药物细胞毒性评估方面应用的相关研究。
　　采用循环伏安方法制备了钙黄绿素修饰电极(PCA/GCE)，研究了制备工艺条件及对嘌呤的电催化性能。确定的最佳工艺条件为pH7.4，扫描20圈，聚合电位-1.4~1.8V。在此条件下所制备的PCA/GCE对黄嘌呤(XA)、鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)和次黄嘌呤(HX)四种嘌呤的电化学氧化均有较高的催化性，对尿酸(UA)、XA和HX同时检测的线性范围分别为0.20~80μmol/L、0.20~80μmol/L和0.50~90μmol/L；检测限分别为0.12、0.12和0.30μmol/L。干扰性实验研究表明PCA/GCE可以在高浓度生理干扰物存在下对三种物质进行高选择性测定。将PCA/GCE应用于实际尿样检测，回收率达到96.0％~107.0%。
　　利用PCA/GCE宽的电位窗及对嘌呤良好的催化性，进一步将其应用于MCF-7细胞的伏安行为研究中，同时检测到了细胞的两个电化学信号，并且在pH7.4、富集时间200s和富集电位-1.0V的检测条件下，细胞的两个电化学信号的响应电流最大。细胞浓度与氧化电流之间被证明在较宽的细胞浓度范围内呈非线性指数关系，对应信号Ⅰ和Ⅱ的指数方程分别为Ipa=7.458 6.415exp(-C/52380)(R2=0.986)和Ipa=4.023 3.773exp(-C/228700)(R2=0.984)，检测限分别为2.0×103cells/mL和3.0×103cells/mL。在环磷酰胺的细胞毒性实验中，细胞的两个电化学信号均随环磷酰胺给药浓度增加而不同程度的降低，说明细胞的活性和药物浓度间存在剂量-效应抑制关系。并通过传统MTT方法验证了细胞电化学法的药物毒性检测结果的可靠性。基于电化学信号Ⅰ和Ⅱ的最大抑制率分别为58.4%和69.4%，MTT方法获得的抑制率为59.2%。
　　为降低电化学检测所使用的样品量，采用循环伏安技术制备了苏氨酸修饰铅芯电极(PT/GCE)。研究了四种嘌呤分别在PT/GCE上的伏安行为，基于PT/GCE良好的催化性能，构建了集成PT/GCE、Ag/AgCl真参比电极和铂丝三电极的电化学微检测系统，并对微检测系统的电化学性能进行了研究。通过对比铁氰化钾在微电解池与常规检测池中的伏安响应情况，验证了电化学微检测系统在节约90%以上样品使用量的同时，具有和常规检测系统相同的灵敏度，证明此系统用于微量样品检测的可行性。
　　采用构建的电化学微检测系统对微量MCF-7细胞的伏安行为进行了研究，细胞在pH7.4，富集时间480s和富集电位-1.0V等检测条件下具有最强的伏安响应。研究了细胞浓度与电化学信号响应电流间的函数关系，证明在较宽细胞浓度范围内细胞浓度与氧化电流之间呈现非线性指数关系，指数方程为Ipa=59.557exp(-C/1.709)–71.486(R2=0.954)。进一步将此电化学微检测系统用于环磷酰胺的细胞毒性效应研究中，获得与MTT方法同样的结果，证明基于此微检测系统的电化学法的可靠性。
　　为进一步提高微检测系统的灵敏度，构建了基于碳纳米管/苏氨酸复合膜修饰铅芯电极阵列的微检测系统(MT/PGEA)，并研究了MT/PGEA的制备条件及对嘌呤的催化氧化性能。通过对比嘌呤在不同电极上的伏安响应，得到各电极对嘌呤氧化的催化效果依次为：MT/PGEA>MT/PGE>PT/PGE>PGE。同时确定XA、G、A和HX在MT/PGEA上的检测限依次为0.025、0.025、0.050和0.050μmol/L，此系统可用于微量细胞敏感检测中。

目录

第1章 绪 论

1.1 课题背景及研究目的和意义

1.2 化学修饰电极的发展状况

1.3 细胞电化学在生物毒性检测中的应用

1.4肿瘤细胞电化学研究进展

1.6 本文的主要研究内容

第2章 实验材料和方法

2.1 实验材料和仪器

2.2 修饰电极的制备和电化学微检测系统构建

2.3 MCF-7细胞培养和毒性试验

2.4 表征和测试方法

第3章 PCA/GCE的构建及催化性能研究

3.1 引言

3.2 PCA/GCE构建中工艺参数的选择确定

3.3 PCA/GCE的表征

3.4 PCA/GCE用于检测嘌呤伏安行为的研究

3.5尿酸和混合嘌呤的伏安行为研究

3.6本章小结

第4章 基于PCA/GCE的抗癌药物细胞毒性效应研究

4.1 引言

4.2 MCF-7细胞在PCA/GCE上的伏安行为研究

4.3 细胞浓度与MCF-7细胞电化学信号的响应关系

4.4 环磷酰胺对MCF-7细胞的毒性效应评价

4.5 本章小结

第5章 基于PT/PGE的电化学微检测系统细胞毒性效应研究

5.1 引 言

5.2 PT/PGE的制备及催化性能研究

5.3 电化学微检测系统电化学性能的研究

5.4基于微检测系统的药物毒性效应评估

5.5 本章小结

第6章 基于MT/PGEA的电化学微检测系统的构建

6.1引言

6.2 MT/PGEA的制备工艺优化

6.3 MT/PGEA的表征

6.4 MT/PGEA对嘌呤氧化的催化性研究

6.5 嘌呤在MT/PGEA上的检测限的确定

6.6 嘌呤在MT/PGEA上的反应动力学研究

6.7尿酸和嘌呤在MT/PGEA上的伏安行为研究

6.8 本章小结

结论

创新点

展望

参考文献

附录一

攻读博士学位期间发表的论文及其它成果

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致谢

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