中药疫毒清制剂抗流感病毒作用研究

摘要

目的： 疫毒清(Depestia)为鸭跖草(CommelinacommunisL)提取物(总生物碱类)。中药鸭跖草为鸭跖草科植物鸭跖草(CommelinacommunisL)的地上部分。采用渗漉技术和离子交换技术提取鸭跖草中具有抗病毒作用的生物碱类成分，制备得到疫毒清制剂。分别作体内和体外抗流感病毒研究，体外以MDCK细胞为研究对象，体内以昆明小鼠为研究对象，评估疫毒清的药效。 方法： 1、病毒的增殖与滴定：流感病毒A采用鸡胚和MDCK细胞增殖，以血凝实验判断病毒效价，MDCK细胞进行病毒TCID50滴定。 2、疫毒清体外抗病毒实验：将疫毒清由母液对半稀释得到浓度梯度。MTT法测定药物的细胞毒性，药效学实验在无毒浓度范围内，在96孔细胞培养板加入不同浓度的药物0.1ml，吸附100TCID50的病毒液0.1ml；采用治疗组和预防组两种给药方式，每日观察病毒致细胞病变效应，约在病毒对照组细胞出现+++CPE时用MTT法染色测各孔570nm处OD值并计算半数抑制浓度(半数有效浓度)得到药物的治疗指数。 3、疫毒清体内抗病毒实验：小鼠滴鼻感染流感病毒，建立病毒感染的动物模型。死亡保护作用：将60只小鼠(SPF级，18～20g，雌雄各半)随机分为6组，每组10只。将给药组与模型组的小鼠滴鼻感染10ID50病毒液，感染2h后给药组分别灌胃给予高、中、低浓度的疫毒清与病毒唑，持续给药7天，观察14天，每天观察并记录动物的反应、出现死亡的时间和死亡数。对流感病毒所致肺炎的影响：将给药组与模型组的小鼠滴鼻感染10ID50病毒液，感染2h后给药组分别灌胃给予高、中、低浓度的疫毒清与病毒唑，持续给药7天，处死动物，无菌取肺，称肺重，肉眼观察肺脏变化，计算肺指数和肺病变抑制率，并做小鼠肺组织病理切片观察。 4、小鼠肺组织匀浆做RT—PCR流感病毒核酸检测： 取100mg肺组织经过总RNA的提取，逆转录反应，实时荧光定量PCR检测流感病毒RNA的相对含量，比较给药组与模型组的差别。 此反应还包括设计引物，确立反应体系，设置反应条件等步骤。 结果： 1、MTT试验：药物组各浓度的光密度OD值(代表活细胞数目)与病毒对照组的光密度进行组间t检验，在高浓度时，P＜0.05，有显著性差异，说明疫毒清制剂能够抑制流感病毒增殖，使较多的细胞存活。 2、常规检测中，疫毒清各剂量组对小鼠的肺指数均显著低于病毒模型组，P＜0．01；存活天数明显高于病毒模型组P＜0.05或P＜0．01。 3、RT—PCR检测：流感病毒RNA的含量(105拷贝/L)为高剂量组：39.29±6.06、中剂量组：36.09±8.19、低剂量组：40.36±8.62均与病毒模型组：50.16±6.73有显著性差异，P＜0.05。 结论： 疫毒清体外实验两组数据的治疗指数(11.06和11.75)，可见疫毒清对流感病毒的治疗与预防，均显示了一定的效果，具有抗流感病毒的作用。疫毒清体内实验肺指数，存活天数，肺组织匀浆流感病毒含量，肺组织病理切片等实验结果均说明疫毒清确能抑制甚至杀灭流感病毒，从而减弱流感病毒对肺部组织的感染，改善流感导致的肺病变，具有抗流感病毒的作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

前言

一、立题依据

二、课题的设计

三、实验的可行性分析

第一部分疫毒清制剂的制备材料与方法

一、实验材料

二、实验方法

结果与分析

第二部分疫毒清制剂体外抗流感病毒作用研究

材料与方法

一、实验材料

二、实验方法

结果与分析

第三部分疫毒清制剂体内抗流感病毒作用研究

材料与方法

一、实验材料

二、实验方法

结果与分析

讨论

1、组织培养技术在抗病毒药物研究中的应用

2、MTT法在抗病毒药物筛选中的应用

3、PCR技术的发展与应用

结语

参考文献

附录

文献综述：中医药抗流病毒概况与展望

致谢