基于富勒烯的支架材料研制及在心肌组织工程的应用

摘要

我国心肌梗死的发病率和死亡率居高不下，且呈现年轻化和逐渐上升的趋势。目前临床上常用治疗手段仅能起到缓解症状和一定程度上改善患者生存质量的作用，无法从根本上解决受损心肌的修复和重建问题。可注射性心肌组织工程策略为受损心肌组织的有效修复提供了新思路，然而，目前常用的可注射性材料在设计上并未考虑心梗部位过多氧自由基（ROS）的恶劣微环境以及心肌的导电特性，因此研制兼具抗氧化能力和导电特性的支架材料具有重要意义。富勒烯具有良好的导电特性，更为重要的是其衍生物-富勒醇具有优良的抗氧化特性。为此，本论文将重点阐明富勒烯对大鼠棕色脂肪干细胞（BADSCs）存活、增殖和向心肌分化的作用规律及相关分子机制，在此基础上，制备兼具抗氧化能力和导电特性的富勒醇/海藻酸钠水凝胶，研究其在ROS微环境下对BADSCs的存活、增殖及向心肌细胞分化的调控规律及相关分子机制，探索其动物体内对受损心肌的修复作用。
　　通过显微镜观察、流式细胞仪检测、免疫荧光染色、透射电镜观察、蛋白印迹、实时定量PCR等检测手段，系统研究了不同浓度富勒烯对BADSCs毒性、增殖及向心肌细胞分化的调控规律及分子机制，结果发现富勒烯具有良好的细胞相容性，高达100μg/mL的富勒烯对BADSCs仍无细胞毒性。富勒烯可以被BADSCs摄取进入细胞内，通过调控MAPK家族信号通路（ERK MAPK和p38MAPK）蛋白的表达量，促进了BADSCs心肌特异性蛋白和基因的表达，从而提高BADSCs的增殖及向心肌细胞分化的能力。同时，可提高细胞间缝隙连接蛋白Connexin43的表达，进而促进了细胞间的通讯能力。
　　通过化学修饰技术制备了水溶性的富勒烯衍生物-富勒醇，并以具有良好生物相容性的海藻酸钠为基材，以葡萄糖酸钙为交联剂，制备了可注射性富勒醇/海藻酸钠水凝胶。系统研究了水凝胶组成对其抗氧化能力和导电特性的调控规律。研究发现，该水凝胶的导电特性良好，且其电导率的升高与富勒醇含量的增加具有相关性，当水凝胶中富勒醇的浓度达到600μg/mL时，其电导率可达（0.41±0.09）10-4S cm-1。同时该水凝胶具有有效清除羟自由基和有机氧自由基的能力，清除效率同样与富勒醇的浓度成正比。在此基础上，将BADSCs细胞包裹到富勒醇/海藻酸钠水凝胶中，通过组织学染色、免疫荧光染色、透射电镜观察、蛋白印迹、实时定量PCR等检测手段，系统研究了在ROS微环境下材料性能对BADSCs氧化应激损伤、增殖、及向心肌细胞分化的作用规律及相关分子机制。结果发现，富勒醇/海藻酸钠水凝胶具有良好的生物相容性，更为重要的是富勒醇的引入可明显减小ROS对BADSCs细胞的氧化应激损伤，提高其存活和增殖相关信号通路p-ERK及p-p38的表达，降低凋亡相关信号通路p-JNK蛋白的表达。此外还可以促进α-Actinin、cTnT和Cx-43这些心肌特异性蛋白的表达，同时对α-actin、cTnT和GATA-4这些心肌特异性基因的表达也具有一定的促进作用，进而调控BADSCs向心肌细胞分化的能力。综合分析以上结果，100μg/mL的富勒醇/海藻酸钠水凝胶对BADSCs的抗氧化效应、促进其增殖和向心肌分化的能力比较理想。
　　在上述研究基础上，制备了大鼠心梗模型，将所研制的富勒醇/海藻酸钠水凝胶携带BADSCs注射到大鼠心梗区域，通过组织化学染色、免疫荧光染色、心脏超声及激光多普勒技术详细研究了其对体内心梗微环境的调控作用及对受损心肌的修复作用。研究发现，富勒醇的引入可明显降低心梗区活性氧自由基数量，且与空白对照组相比，100μg/mL的富勒醇/海藻酸钠水凝胶携带BADSCs注射修复心梗的效果最好，可明显增加梗死区域血管密度，减小心梗部位面积，增加心室壁厚度，改善心功能和减小心肌损伤，从而延缓了心肌梗死后心室重塑进程。
　　综上所述，本研究成功研制了兼具抗氧化能力和导电特性的心肌组织工程用水凝胶材料，并从材料水平、细胞水平、蛋白水平、基因水平、动物水平系统阐明了材料性能对BADSCs的存活、增殖及向心肌细胞分化的调控作用及相关分子机制，探索了其治疗心肌梗死的可能性，为心肌组织工程用生物材料的研制提供了一定的理论基础和实验依据。

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第1章 绪 论

1.1研究背景及来源

1.2 心肌组织工程研究进展

1.3碳纳米材料在生物医学领域的应用

1.4生物材料调控干细胞分化研究进展

1.5 心梗微环境对移植细胞存活和分化影响

1.6本课题的研究目的、研究内容及技术路线

第2章 实验材料与方法

2.1实验材料

2.2 实验方法

第3章 富勒烯对BADSCs生物学行为的调控作用及相关分子机制

3.1 引言

3.2 BADSCs的分离与培养

3.3 BADSCs的鉴定和定向分化

3.4富勒烯对BADSCs活性的调控作用

3.5 BADSCs对富勒烯的摄取和定位

3.6富勒烯对BADSCs增殖行为的调控作用及分子机制

3.7富勒烯对BADSCs向心肌细胞分化的调控作用

3.8富勒烯对BADSCs生物学行为的影响

3.9本章小结

第4章 富勒醇/海藻酸钠水凝胶制备、表征、评价及其对BADSCs生物学行为调控作用

4.1 引言

4.2富勒醇的制备与表征

4.3富勒醇/海藻酸钠水凝胶的流变学性能

4.4富勒醇/海藻酸钠水凝胶的电化学性能

4.5富勒醇/海藻酸钠水凝胶抗氧化性能

4.6富勒醇/海藻酸钠水凝胶的细胞毒性

4.7 BADSCs在富勒醇/海藻酸钠水凝胶中的增殖行为

4.8 富勒醇/海藻酸钠水凝胶对 BADSCs 氧化应激损伤的保护作用

4.9本章小结

第5章 富勒醇/海藻酸钠水凝胶携带BADSCs体内心梗移植修复研究

5.1 引言

5.2 CM-DiI标记后BADSCs的形态

5.3大鼠心梗模型的制备及心电图检测结果

5.4富勒醇/海藻酸钠水凝胶对心梗微环境的改善作用

5.5 富勒醇/海藻酸钠水凝胶对 BADSCs 心梗部位心肌分化的作用

5.6富勒醇/海藻酸钠水凝胶对心梗部位血管形成的作用

5.7富勒醇/海藻酸钠水凝胶对心梗区炎症反应的调节作用

5.8富勒醇/海藻酸钠水凝胶对受损心肌的修复作用

5.9心功能研究

5.10受损心肌表面血流灌注量研究

5 . 11本章小结

结论

参考文献

攻读博士学位期间发表的学术论文及其它成果

声明

致谢

个人简历