外周神经损伤对DRG和脊髓神经细胞GIRK家族蛋白表达的影响

摘要

伤害性神经元兴奋性的增强是慢性疼痛发生和发展的基础。多种离子通道，包括钠离子通道、钙离子通道和钾离子通道在控制神经元的兴奋性上起到重要作用。G蛋白门控内向整流钾离子（GIRK）通道已被证实能够调控神经元的兴奋性。此前的研究报道GIRK通道四个亚单位的mRNA在大鼠和人类背根神经节（DRG）中均有所表达。功能性的GIRK通道是由其亚单位成员中的一个或两个组成的同源四聚体或异源四聚体。GIRK通道通过与抑制性G蛋白偶联受体（G protein coupled receptors，GPCRs）的相互作用而被激活并开放，钾离子外流，使膜电位变得更“负”，从而降低神经元的兴奋性。本论文旨在系统地研究GIRK通道亚单位在正常大鼠DRG和脊髓中表达的神经化学特性，以及通过构建外周神经损伤的大鼠神经病理性疼痛模型研究外周神经损伤对GIRK通道四个亚单位的表达调控，分析和阐述GIRK通道在神经病理性疼痛发生和发展中所起到的作用。
　　本研究利用免疫组织化学实验和定量分析等方法确定了GIRK通道亚单位在正常大鼠腰椎4-5（L4-5）节段DRG组织和L5脊髓组织中的表达和分布情况。在正常大鼠DRG中~70％和<10%的神经元分别表达GIRK1和GIRK2。利用降钙素基因相关肽（CGRP）、植物凝集素B4（IB4）和神经丝蛋白-200（NF200）抗体分别标记DRG中的小型无髓鞘肽能神经元、小型无髓鞘非肽能神经元和中大型有髓鞘神经元，激光共聚焦共定位研究结果表明GIRK1和GIRK3广泛地表达于这三种神经元类群，而GIRK2仅表达于CGRP和NF200阳性神经元类群。进一步使用四种钙离子结合蛋白钙结合蛋白D28k（CB）、钙视网膜蛋白（CR）、小清蛋白（PV）和促泌素蛋白（Scgn）抗体标记不同的DRG神经元类群，对GIRK通道亚单位的表达特性进行进行地分析，结果表明GIRK1与四种钙离子结合蛋白均存在不同程度上的共定位关系，而GIRK2只在CB阳性神经元中表达。为分析GIRK1~4在脊髓背角中的表达特性，使用不同的标记物分别标记DRG神经元轴突在脊髓背角投射末端分布的薄层（lamina），其中，GIRK1和GIRK2主要表达于lamina Ⅱ，GIRK3和GIRK4主要表达于lamina I和外层lamina Ⅱ。此外，GIRK1~4与VGLUT1或VGLUT2的共定位研究结果表明GIRK1~4在脊髓背角存在突触前膜定位。利用神经元标记物NeuN标记脊髓背角神经元，结果表明GIRK1和GIRK2广泛地表达于不同lamina区域的局部神经元，但是GIRK3和GIRK4不表达于局部神经元。
　　为研究外周神经损伤对GIRK通道亚单位表达调控，我们通过大鼠坐骨神经离断（axotomy）手术制备了外周神经损伤引起的神经病理性疼痛模型。通过免疫组织化学实验、原位杂交实验、实时荧光定量PCR实验、western blot实验和定量分析等方法对GIRK1~4在mRNA和蛋白质水平上的表达情况进行分析。结果表明损伤侧DRG和脊髓背角中GIRK1、GIRK2和GIRK4的表达均显著下调，而GIRK3的表达显著上调。结合此前的研究结果进行分析，GIRK3表达的上调能够降低神经元细胞膜的GIRK1/2和GIRK2/2通道。
　　为研究GIRK通道亚单位在DRG神经元中的轴突转运，分别利用大鼠坐骨神经结扎（ligation）模型和脊髓神经背根切除（rhizotomy）模型研究在DRG神经元中合成的GIRK1~4向外周端和中枢端运输情况。实验结果表明GIRK1~4均存在向外周和中枢运输的顺行转运，此外，GIRK1~3存在外周轴突末端向胞体端运输的逆行转运。利用免疫组织化学实验，进一步检测了GIRK1~4在正常大鼠坐骨神经和后爪无毛皮肤中的表达和分布，结果表明GIRK1~4广泛地表达于包括感觉纤维在内的多种类群的神经纤维，且GIRK1~4均表达于后爪无毛皮肤真皮层中的神经末端。
　　综上所述，本研究首次系统地阐述了GIRK通道四种亚单位在大鼠DRG和脊髓中表达的神经化学特性，并通过外周神经损伤模型和多种分子生物学实验方法证明了GIRK通道在神经病理性疼痛情况下的表达下调。GIRK通道表达的下调会引起感觉神经元的过度兴奋，可能是神经病理性疼痛产生和长时程维持的重要原因。

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第1章 绪 论

1.1课题研究背景及目的和意义

1.2背根神经节（Dorsal root ganglion, DRG）和脊髓研究进展

1.3神经病理性疼痛的产生机制及其研究进展

1.4神经病理性疼痛动物模型和定量检测

1.5 G 蛋白门控内向整流钾离子（ G protein-gated inwardly rectifying potassium, GIRK/Kir3）通道研究进展

1.6本文的主要研究内容和技术路线

第2章 实验材料与方法

2.1引言

2.2实验材料

2.3实验方法

2.4定量分析

2.5统计学分析

2.6本章小结

第3章GIRK通道在大鼠神经系统中的表达特性

3.1引言

3.2 GIRK1在正常大鼠神经系统中的表达

3.3 GIRK2在正常大鼠神经系统中的表达

3.4 GIRK3在正常大鼠神经系统中的表达

3.5 GIRK4在正常大鼠神经系统中的表达

3.6 GIRK通道在大鼠DRG中的表达分析

3.7 GIRK通道在大鼠脊髓中的表达分析

3.8 GIRK通道与GPCRs相互作用的分析

3.9本章小结

第4章 外周神经损伤对GIRK通道表达的调控

4.1引言

4.2大鼠坐骨神经离断模型的建立

4.3外周神经损伤对GIRK1在大鼠DRG和脊髓中的表达调控

4.4外周神经损伤对GIRK2在大鼠DRG和脊髓中的表达调控

4.5外周神经损伤对GIRK3在大鼠DRG和脊髓中的表达调控

4.6外周神经损伤对GIRK4在大鼠DRG和脊髓中的表达调控

4.7神经病理性疼痛动物模型分析与介绍

4.8坐骨神经离断模型分析

4.9外周神经损伤对GIRK通道亚单位表达调控的分析

4.10外周神经损伤导致伤害性信号在脊髓背角神经元汇聚

4.11本章小结

第5章GIRK通道亚单位的轴突转运

5.1引言

5.2大鼠坐骨神经结扎模型的建立

5.3大鼠脊髓背根神经切除模型的建立

5.4 GIRK1的轴突转运

5.5 GIRK2的轴突转运

5.6 GIRK3的轴突转运

5.7 GIRK4的轴突转运

5.8轴突转运分析

5.9快速的顺行和逆行轴突转运分析

5.10本章小结

结论

参考文献

附 录Ⅰ

附 录Ⅱ

附 录Ⅲ

攻读博士期间发表的学术论文及其它成果

声明

致谢

个人简历