Qpct及Aqp1在小鼠胎盘的印记鉴定及表达调控机制研究

摘要

Qpct（glutaminyl-peptide cyclotransferase）及Aqp1（Aquaporin-1）基因分别位于小鼠的17号和6号染色体。Qpct基因编码的蛋白名称为谷氨酰基环化酶，其在β淀粉样蛋白的形成中发挥重要作用，且该淀粉样蛋白的过度积累是阿尔兹海默病的诱因，进一步研究发现 Qpct基因对一些癌症产生抑制作用。Aqp1基因编码的蛋白是水通道蛋白家族成员之一，在生物体中负责水分的运输，因此在生物的生长过程中发挥重要的作用。鉴于Qpct及Aqp1在小鼠中的印记状态及胚胎发育中的功能尚不清楚，因此，本文通过 SNP位点测序法对Qpct及Aqp1在小鼠胚胎及胎盘发育中的印记状态进行鉴定；通过了解Qpct及Aqp1基因在胚胎及胎盘发育中的表达模式及调控机制，揭示两者在胚胎及胎盘发育中的潜在功能；并通过Aqp1敲除鼠模型研究该印记基因对胚胎及胎盘发育中的产生的影响，旨在揭示Aqp1在小鼠胚胎发育中的重要作用。
　　本研究首先对生物信息学筛选出的两个基因Qpct及Aqp1进行了印记鉴定。利用基因上存在的SNP位点对E15.5小鼠胚内及胚外组织的cDNA进行测序，结果表明Qpct及Aqp1只有在小鼠胎盘中的SNP位点处测序峰是单峰，且都只母本表达，而在胚胎的各组织中 SNP处均为双等位表达。由此可见，小鼠的Qpct及 Aqp1基因均是只在胎盘中特异性母本表达、父本印记的印记基因。其次，本研究分析了小鼠Qpct基因的时空表达谱及其印记的调控机制。通过实时定量PCR、原位杂交(切片或全胚胎)及免疫组化的实验方法对印记基因Qpct在胚胎及胎盘中的表达特点进行分析。定量结果表明，Qpct基因在胚胎发育的囊胚期表达较高，在 E8.5-E15.5胚胎发育中后期 Qpct基因表达逐渐升高， E12.5-E18.5胎盘发育中后期 Qpct基因的表达表现为先升高后降低的趋势，且E15.5为表达峰值时期。原位杂交数据表明Qpct基因主要在中期胚胎的脑、神经管、听泡中高表达，后期胚胎中该基因广泛表达，且在脑、肺、肝中表达最高。胎盘中后期（E12.5-E18.5）免疫组化结果表明，Qpct基因主要在蜕膜层及迷路层高表达。研究发现，Qpct基因的启动子区上存在一个CpG岛，对该CpG岛进行甲基化分析及 ChIP实验，证实该CpG岛不调控基因的印记，但可以调控其在胚胎内主要脏器中的表达，而组蛋白H3K4me3可以调控该基因的母本表达、父本印记。最后，本文对Aqp1的时空表达谱、表达调控机制及功能进行了研究。通过实时定量PCR结果表明，Aqp1在胚胎发育中后期（E8.5-E15.5）表达逐渐升高，E15.5时表达最高，且主要在肺、肝中表达较高，在脑及肾脏中表达较低。E15.5胎盘免疫组化结果表明，Aqp1基因主要在胎盘的蜕膜层及迷路层高表达。Aqp1基因从目前的生物信息库数据中未见 CpG岛的存在，但通过分析发现该基因的启动子区(region A)及第一外显子(region B)有较大密度的CG位点存在。甲基化分析结果表明，region A和region B的甲基化调控了该基因在胚胎及胎盘中的表达。利用Aqp1敲除鼠模型，对Aqp1基因在胚胎及胎盘发育中的功能进行探索。实验结果表明，Aqp1-/+（母本缺失）及Aqp1-/-（双缺失）小鼠胎盘变大，同时胎盘与胚胎的重量明显增加，胎盘中间层及迷路层均出现明显扩增，且迷路区的血管数目及分支明显增多。证实在小鼠孕期，Aqp1基因主要通过调节胎盘供给给胚胎的营养物质对胚胎的发育产生抑制作用。
　　综上所述，本文鉴定出两个胎盘特异性的印记基因 Qpct及 Aqp1，两者在小鼠胚胎及胎盘的发育中广泛表达。Qpct基因的母本表达、父本印记受到了组蛋白H3K4me3的调控。Aqp1的启动子区(region A)及第一外显子(region B)共同调控该基因在胚胎及胎盘中的表达，同时发现Aqp1基因对小鼠孕期胚胎及胎盘的生长发育具有重要的抑制作用。

目录

第1章 绪 论

1.1课题的来源及研究目的

1.2表观遗传学概述

1.3印记基因的研究进展简介

1.4印记基因调控模式的研究

1.5新鉴定印记基因Qpct及Aqp1的研究进展

1.6本文的主要研究内容及技术路线

第2章 实验材料和方法

2.1实验材料

2.2实验方法

2.3本章小结

第3章 全基因组范围内对印记基因的预测及鉴定

3.1引言

3.2生物信息学预测候选的印记基因

3.3 Qpct在小鼠胚胎及胎盘中的印记鉴定

3.4 Aqp1在小鼠胚胎及胎盘中的印记鉴定

3.5本章小结

第4章 Qpct在小鼠中表达谱及印记调控机制的研究

4.1引言

4.2 Qpct基因在小鼠胚胎及胎盘发育中的表达模式

4.3甲基化对Qpct基因印记调控的作用

4.4组蛋白修饰对Qpct的印记调控机制的作用

4.5本章小结

第5章 Aqp1在小鼠中表达谱及其功能的研究

5.1引言

5.2 Aqp1基因在小鼠胚胎及胎盘发育中的表达模式

5.3 Aqp1基因在小鼠胚胎主要脏器中的差异甲基化分析

5.4敲除Aqp1对小鼠胎盘发育的影响

5.5四种基因型小鼠中Aqp1基因对胚胎发育的影响

5.6本章小结

结论

参考文献

附 录Ⅰ

附 录Ⅱ

攻读博士学位期间发表的论文及其它成果

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致谢

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