t-PA基因对黄瓜的遗传转化及其在不同植物中的表达效率分析和密码子改造

摘要

组织型纤溶酶原激活剂(tissue-type plasminogen activator,t-PA)是一种高效特异的溶血栓药物,被广泛地应用于血管栓塞性疾病的治疗.目前t-PA已经在大肠杆菌生物体中成功表达并产业化,但生产成本昂贵.由于植物表达系统具有生产成本较低、表达产物安全性高、便于大规模生产和储运等特点,因此以转基因植物为生物反应器生产t-PA目前已成为研究热点.但植物表达系统存在外源基因表达量低的问题,极大地限制了转基因植物在基因工程药物生产上的应用.该研究以黄瓜为生物反应器,进行t-PA的表达.针对外源基因表达量低的问题,对t-PA基因进行了重新设计,并将新设计的t-PA基因转化黄瓜,获得了转基因PCR阳性植株;同时对马铃薯、黄瓜和草莓的密码子用法进行分析,预测了t-PA基因在3种生物体中的表达情况,进行了适于植物中表达的t-PA基因密码子改造.

目录

文摘

英文文摘

1引言

1.1本项研究的目的和意义

1.2基因工程药物概述

1.2.1医药基因工程表达系统

1.2.2医药基因工程产业现状

1.3植物医药基因工程

1.3.1植物医药基因工程表达系统

1.3.2植物医药基因工程研究进展

1.3.3生物体密码子分析

1.4t-PA研究现状

1.4.1 t-PA概述

1.4.2t-PA蛋白质工程

2材料和方法

2.1 t-PA基因植物表达载体构建

2.1.1实验材料

2.1.2实验方法

2.2黄瓜植株再生体系建立

2.2.1试验材料

2.2.2试验方法

2.3农杆菌介导遗传转化

2.3.1试验材料

2.3.2试验方法

2.4转基因植株分子生物学检测

2.4.1 PCR检测

2.4.2 Southern blot检测

2.5植物密码子用法分析

2.5.1实验材料

2.5.2实验方法

2.6 t-PA基因在植物中表达情况预测和密码子改造

2.6.1实验材料

2 6 2实验方法

3实验结果

3.1 t-PA基因植物表达载体构建

3.1.1载体pUC构建

3.1.2t-PA基因扩增和PCR产物克隆

3.1.3 mt-PA基因扩增和PCR产物克隆

3.1.4中间载体pBE2113构建

3.1.5中间载体pBEC构建

3.1.6植物表达载体pBET构建

3.1.7植物表达载体pBEMT构建

3.2黄瓜植株再生体系建立

3.2.1影响黄瓜子叶节再生频率的因素

3.2.2植株再生

3.3农杆菌介导遗传转化

3.3.1卡那霉素筛选浓度确定

3 3 2t-PA和mt-PA基因对黄瓜的遗传转化

3.4转基因植株分子生物学检测

3.4.1 PCR检测

3.4.2 Southern blot检测

3.5植物密码子用法分析

3.5.1 Nc值的计算和高低表达样本组的确定

3.5.2样本总体RSCU值的计算

3.5.3高低表达样本组RSCU值的计算和高表达优越密码子的确定

3.6t-PA基因在植物中表达情况预测和密码子改造

3.6.1 t-PA基因在植物中表达情况预测

3.6.2t-PA基因密码子改造

4讨论

4.1植物医药生物反应器的优点与问题

4.1.1植物医药生物反应器的优点

4.1.2植物生物反应器生产基因工程药物中存在的问题

4.1.3提高植物表达系统表达效率的措施

4.2密码子用法分析

4.3外源基因密码子改造

4.4黄瓜植株再生体系建立

4.4.1外植体选择

4.4.2 PGR对黄瓜植株再生的影响

5结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

附录

致谢