水稻（Oryza sativa L.）Osgrp-2启动子维管束特异表达元件及其反式作用因子研究

摘要

富含甘氨酸蛋白质(GRP)是广泛存在于植物细胞壁的一种重要结构蛋白,GRP基因的表达具有组织特异性、受发育阶段和多种环境因素的调控,因此GRP基因为植物基因的表达调控研究提供了一个良好的模式.我们克隆到的水稻GRP基因Osgrp-2在水稻中的表达有明显的组织特异性和发育阶段特异性,并且可以受到病毒侵染和机械损伤的诱导.在烟草原生质体瞬间表达系统中对其2.4 Kb的启动子序列所做的系列缺失分析表明,该启动子的活性同时受到正调控片段(-2290/-1406)和负调控片段(-2401/-2291,-1405/-1022)的影响.该启动子的G6片段(-1021/+2)在转基因烟草和转基因水稻中都能指导GUS报告基因在维管束组织特异表达,说明其中含有决定维管束表达特异性的启动子顺式元件.对G6片段(-1021/+2)做进一步的缺失与35S-89基本启动子融合在转基因烟草中检测其组织表达特性表明,位于-497和-399之间的99bp的启动子区域(暂定名为VS99)含有决定G6启动子在转基因烟草维管束特异表达的顺式元件.该工作针对Osgrp-2启动子中的VS99片段特性进行了严格的功能获得实验:首先将VS99片段通过同尾酶克隆技术做成正向串联重复,并与35S-89基本启动子形成嵌合启动子,然后利用HindⅢ/EcoRⅠ切点将各种嵌合启动子的表达框架克隆到植物表达载体pBI121上,并在相应转基因烟草中检测报告基因GUS的组织表达特性,结果表明VS99片段能指导GUS在维管束特异表达.为了鉴定VS99片段中顺式元件,该文提取了在温室中生长的六周龄烟草(SRI)地上部分(茎和叶)的细胞核蛋白,进行了初步的电泳迁移率变动分析(EMSA),结果显示VS99片段之中含有与核蛋白特异结合位点.将VS99片段与已有的五种维管束特异的启动子进行序列比较,确定其中的13bp为指导维管束特异表达的高度保守的序列;利用此13bp构建三拷贝的诱饵序列做酵母单杂交实验在水稻cDNA表达文库中筛选与此13bp的顺式元件结合的反式作用因子,共获得45个克隆,经PCR鉴定其中23个扩增出特异的片段,准备测序并在NCBI上进行序列比对.

目录

文摘

英文文摘

缩略语

1前言

1.1植物富含甘氨酸蛋白研究概况

1.1.1概述

1.1.2 GRP的结构特征

1.1.3 GRP的细胞定位

1.1.4 GRP基因的表达调控

1.1.5功能推测

1.1.6展望

1.2维管束特异表达启动子

1.2.1植物启动子的结构和研究方法

1.2.2植物启动子的类型

1.2.3维管束特异性启动子

1.3本文的工作背景、目的、意义及内容

1.3.1工作背景

1.3.2本工作的内容

1.3.3本工作的目的及意义

2材料与方法

2.1实验材料

2.1.1菌株

2.1.2植物材料

2.1.3生化试剂和引物合成

2.2实验方法

2.2.1大肠杆菌质粒提取

2.2.2 DNA操作

2.2.3大肠杆菌和农杆菌的电击转化方法

2.2.4农杆菌介导的叶盘法转化烟草

2.2.5植物DNA的微量提取

2.2.6转基因植物GUS组织染色

2.2.7烟草细胞核蛋白的提取

2.2.8电泳迁移率变动分析(EMSA)

2.2.9酵母单杂交

3结果与分析

3.1 VS99片段功能获得实验

3.1.1克隆构建

3.1.2农杆菌介导的叶盘法转化烟草

3.1.3转基因烟草的PCR检测

3.1.4 GUS组织化学染色

3.2 VS99片段中维管束特异的顺式元件的确定

3.2.1 VS99片段与其它维管束特异表达启动子的序列比对

3.2.2 VS99片段电泳迁移率变动分析

3.3酵母单杂交筛选水稻cDNA表达文库

3.3.1诱饵质粒构建

3.3.2水稻cDNA表达文库的构建

3.3.3酵母单杂交筛选

3.3.4酵母阳性克隆PCR鉴定

4讨论

4.1 VS99片段中决定维管束特异表达顺式元件的鉴定

4.2与维管束特异表达顺式元件相互作用的反式作用因子的研究

5结论

参考文献

攻读硕士期间发表学术论文

致谢