中国马传染性贫血病毒驴白细胞疫苗致弱过程中不同代次毒株LTR序列分析

摘要

马传染性贫血病毒(Equine infectious anemia virus,EIAV)是反转录病毒科慢病毒属成员之一,在基因组结构和抗原性上与人艾滋病病毒(HIV)十分相似,可以引起马属动物的一种急性烈性传染病,以贫血、持续感染、反复发热为特征,是马属动物最重要的传染病之一.中国的马传贫驴白细胞弱毒疫苗是迄今为止唯一大规模应用的慢病毒疫苗.马传贫弱毒疫苗致弱路线是:将一株来源于马体的EIAV超强毒力毒株LN经过驴体连续传代100余代使病毒毒力增强后获得了驴强毒株DV(对马和驴均100﹪致死),然后将DV株连续通过驴白细胞进行体外培养驯化,使得病毒毒力完全丧失,而保持了良好的免疫原性,最终培育成功EIAV驴白细胞弱毒疫苗DLA(沈荣显等,1979),DLA进一步通过驴胎皮肤细胞培养驯化,获得了皮肤细胞弱毒疫苗株FD.该试验利用中国拥有的马传染性贫血病毒疫苗培育系统(由强毒到弱毒的不同代次病毒),将保留的不同代次病毒体外接种健康驴白细胞培养物进行复壮,待感染驴白细胞出现CPE后,一定时间内收获病毒,提取其前病毒DNA,以套式PCR方法分别扩增不同代次病毒非编码区5LTR和3LTR基因片断,以双脱氧法测定不同代次病毒的核苷酸序列.结合EIAV致弱过程中病毒生物学特性的变化,并参照已测定的马传贫病毒毒株的序列及已构建的几个不同毒力和细胞嗜性的感染性分子克隆序列,发现在EIAV疫苗致弱过程中几处与病毒毒力变化相关的基因变异位点,即在强弱毒中E-box基序表现出一定的差异,且R区TAR结构、转录起始碱基及Poly(A)附加位点亦发生规律性的改变,同时在中国EIAV增强子区发现新的特异性细胞转录因子结合基序GATA盒子.通过对不同代次病毒LTR序列分析,将病毒致弱的基因变异位点锁定在有限范围之内,为我们明确毒力变化与基因变异之间的相关性,在分子致病机理和免疫保护机制方面的研究奠定重要的病毒分子生物学基础.

目录

文摘

英文文摘

前言

1马传染性贫血病毒概述

1.1 EIAV的研究历史和现状

1.2 EIAV形态结构和理化特性

1.3 EIAV的生物学特性

2马传染性贫血病毒分子生物学研究进展

2.1 EIAV基因组结构

2.2中国EIAV弱毒疫苗减毒路线及其免疫保护机制

3本研究的背景、内容和意义

材料和方法

1材料

1.1病毒和细胞培养

1.2质粒和菌株

1.3引物

1.4试剂

1.5培养基

1.6主要仪器

2方法

2.1 EIAV代次毒的选取及复壮

2.2前病毒DNA的提取

2.3 EIA不同代次毒非编码区5'LTR和3'LTR基因克隆

2.4 EIA不同代次毒非编码区5'LTR和3'LTR序列分析

结果和分析

1 EIA不同代次毒非编码区5'LTR和3'LTRPCR扩增及克隆质粒的鉴定

2 EIA代次毒非编码区5'LTR和3'LTR序列分析结果

2.1 EIAV代次毒LTR序列长度测定结果

2.2 EIAV LTR增强子区的细胞转录因子

2.3 EIAV R区序列的重要变化

2.4 EIAV U5区保守性

讨论

1.EIAV LTR长度的变化与生物学性状的关系

2.引起中国EIAV代次毒LTR长度变化的关键区

3.增强子区细胞转录因子基序发生重要的改变

4.EIAV R区序列发生重要的改变

结论

参考文献

攻读硕士期间发表的学术论文

致谢