猪伪狂犬病免疫胶体金鉴别诊断试剂盒的研制

摘要

伪狂犬病(Pseudorabies，PR)又叫奥叶兹基氏病(Aujeszkysdisease，AD)，是由伪狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus，PRV)又名猪疱疹病毒Ⅰ型(SuiserpesvirusⅠ)所引起的多种家畜、野生动物、伴侣动物和实验动物的一种急性传染病。在自然条件下，本病最常见于猪、牛、羊、犬、猫和鼠类。临床上多以发热、骚痒(猪除外)和急性脑脊髓炎为主要症状。猪和鼠是此病的主要自然宿主和传染源。该病具有高度的传染性，一旦在猪群中出现，将很快通过空气或接触传染给其它猪只和猪场。近年来的研究表明伪狂犬病病毒还能通过乳汁和生殖道感染。特别是在规模化、集约化、现代化的高密度养猪地区，伪狂犬病病毒可在猪群间不断传播，危害尤为严重，除引起死亡和繁殖障碍外，该病还严重影响猪只的生长发育和生产性能，它不仅给养猪业造成了巨大的经济损失(在美国每年仅猪伪狂犬病造成的损失就达数百万美元)，而且它的存在使整个养殖业时刻面临着严重的威胁。PRV归属于α疱疹病毒亚科。目前世界上包括我国在内广泛使用的预防此病的疫苗均带有gE基因缺失的表型特征。本实验根据PRVMin-A株gE基因序列，参考已发表的关于PRVgE蛋白抗原性表位的相关报道，利用PCR方法扩增了PRVgE基因不含信号肽和跨膜区的部分，并克隆到原核表达载体pGEX-6p-1，获得的重组质粒命名为pGEX-gE。用pGEX-gE转化受体菌BL21，用诱导剂IPTG以不同浓度进行诱导。经SDS-PAGE电泳分析证实克隆的部分gE基因获得了表达，融合表达产物大小约为63KD，并在终浓度为0.6mmol/L的IPTG诱导下，3.5h其表达量达到高峰。Wéstern-blot分析证实表达的重组gE蛋白具有抗原反应活性。将表达产物利用亲和层析法纯化后作为抗原。　本试验依据目前国内所应用的伪狂犬疫苗均是gE基因缺失的表型特征。而野毒感染的PRY都含有gE基因这一事实，建立了一种快速、简易的分子鉴别诊断方法——鉴别胶体金免疫层析法(GICA)，用于猪血清中PRV抗体的监测，区分疫苗免疫的动物和自然感染PRV的动物。利用原核表达方法制备伪狂犬gE蛋白抗原，用全病毒抗原包被胶体金。依次将猪伪狂犬标准阳性血清、gE蛋白抗原和伪狂犬全病毒抗原标记在硝酸纤维素(NC)膜上制备成免疫胶体金检测板。检测时血清中PRV抗体与金标抗原结合，沿着NC膜层析移动，与NC膜上相应的配体结合后形成肉眼可见的紫红色斑点。经特异性交叉试验、阻断试验验证该方法特异性、灵敏度较高，利用哈兽研伪狂犬疫苗生产组提供的猪PRV高免血清进行灵敏度测试，并用间接ELISA法做同步对照，结果表明其灵敏度略低于间接ELISA法。此方法快速、简便、结果准确，可用于监测猪血清中的PRV抗体，具有适用价值。

目录

文摘

英文文摘

1引言

1.1伪狂犬病病毒研究进展

1.1.1病毒主要基因及其编码的蛋白质功能

1.1.2与PRV毒力相关的蛋白

1.1.3伪狂犬病病毒的侵入机制

1.2伪狂犬病的诊断技术

1.2.1常规诊断方法

1.2.2血清学诊断方法

1.2.3分子生物诊断方法

1.2.4 ELISA鉴别诊断方法

1.2.5颗粒浓缩免疫荧光试验(PCFIA)

1.3免疫胶体金技术的研究

1.3.1免疫胶体金技术的基本原理

1.3.2以膜为固相载体的胶体金快速诊断技术的基本原理

1.3.3胶体金的制备方法

1.3.4胶体金的制备过程

1.3.5免疫胶体金的应用

1.4本实验的目的和意义

2材料与方法

2.1材料

2.1.1病毒和血清

2.1.2载体、受体菌和试剂

2.1.3主要试剂

2.1.4仪器及设备

2.1.5主要分子生物学软件

2.2实验方法

2.2.1诊断抗原的制备

2.2.2伪狂犬高免血清的纯化

2.2.3免疫胶体金检测板的制备

2.2.4检测

3结果

3.1gE基因蛋白的表达

3.1.1 PRV培养与细胞病变

3.1.2 PRV gE基因的克隆与鉴定

3.1.3 PRVgE基因原核表达载体的构建

3.1.4测序结果

3.1.5 gE蛋白功能区分析

3.1.6 PRVgE基因的表达及产物活性检测

3.2胶体金检测

3.2.1工作浓度的确立

3.2.2特异性检验

3.2.3灵敏度检测

3.2.4阻断实验结果

3.2.5重复性试验结果

3.2.6免疫胶体金试纸检测法与ELISA检测血清样本结果

4讨论

4.1关于伪狂犬病毒gE基因鉴别诊断方法的研究

4.2关于伪狂犬病毒gE蛋白的表达

4.2.1目的基因在原核细胞中的高效表达

4.2.2表达蛋白的生物活性的检测

4.3伪狂犬病毒高免血清纯化过程中硫酸铵饱和溶液的配制

4.4关于伪狂犬病毒抗体胶体金鉴别诊断方法

4.4.1关于胶体金溶液的配制

4.4.2关于胶体金溶液的存放

4.4.3关于伪狂犬病毒抗体胶体金鉴别诊断试剂盒的装配

4.4.4关于伪狂犬病毒抗体胶体金鉴别诊断方法的高特异性

4.4.5关于伪狂犬病毒抗体胶体金鉴别诊断方法的高敏感度

4.4.6关于胶体金标记蛋白的稳定性

4.4.7关于金标抗原的纯化

4.4.8其他

5结论

致谢

参考文献

技术路线

攻读硕士学位期间发表的学术论文