犬IFN-γ及IL-2的原核表达和IL-2生物活性检测

摘要

本文根据GenBank上发表的犬干扰素-γ(Interferon-γ，IFN-γ)和白细胞介素-2(Interteukin-2，IL-2)基因序列，设计了两对引物。采用RT-PCR技术以ConA刺激的犬脾淋巴细胞为材料，从总RNA中扩增出犬IFN-γ和IL-2基因。分离纯化扩增片段，克隆入pMD18-T载体，经酶切鉴定、PCR鉴定及DNA测序分析，表明扩增片段为犬IFN-γ和IL-2基因。测序结果显示克隆的IFN-γ基因全长426个核苷酸，编码141个氨基酸，与基因库中CaIFN-γ比较，核苷酸序列同源性为99.8％，推导的氨基酸序列同源性为99.3％；克隆的IL-2基因全长468个核苷酸，编码155个氨基酸，将该序列与基因库中D30710CaIL-2比较，核苷酸序列同源性为99.36％，推导的氨基酸序列同源性为98.7％。 应用DNA重组技术，将犬IFN-γ和IL-2基因分别插入到原核表达载体PJLA605中，构建原核表达质粒PJLA605-CaIFN-γ和PJLA605-CaIL-2，转化大肠杆菌DH5α，并通过改变诱导时机和诱导表达时间来优化表达条件。结果表明，工程菌PJLA605-CaIFN-γ和PJLA605-CaIL-2在30℃培养至对数生长后期(OD600为1.5)转温诱导4h，菌体湿重收得量分别达18.0g/L和17.8g/L，目标蛋白表达量分别占菌体总蛋白的27.4％和29.4％，这两种基因工程菌得到了理想表达。SDS-PAGE电泳显示，NaCl和TritonX-100可洗去部分杂蛋白，表达产物以包涵体形式存在。尿素溶解包涵体并通过Sephacry1 S-200分子筛初步纯化，包涵体的纯度均达到90％以上。复性后的IL-2蛋白用MTT法检测生物活性，结果显示稀释复性的IL-2蛋白淋巴细胞增殖系数可达2.01，表明此种蛋白具有IL-2的生物活性。

目录

文摘

英文文摘

1前言

1.1 IL-2的研究进展

1.1.1 IL-2的发现及命名

1.1.2 IL-2的结构与产生

1.1.3 IL-2受体的研究

1.1.4 IL-2的理化特性和生物学活性

1.1.5 IL-2的种属特异性

1.1.6 IL-2活性的检测

1.1.7 IL-2的应用

1.2干扰素的研究进展

1.2.1干扰素的发现

1.2.2干扰素的性质和分类

1.2.3干扰素的产生与诱导

1.2.4 IFN的基因结构

1.2.5 IFN-γ的分子结构与生物学作用

1.2.6 IFN抑制病毒复制的作用机理

1.2.7 IFN的应用和发展趋势

1.3本研究的目的和意义

2材料与方法

2.1实验材料

2.1.1菌种与质粒

2.1.2引物

2.1.3试剂

2.1.4主要仪器设备

2.2实验方法

2.2.1犬脾淋巴细胞的制备

2.2.2细胞总RNA的提取

2.2.3 cDNA的合成

2.2.4 IL-2和IFN-γ基因片段的克隆与序列分析

2.2.5 IL-2与IFN-γ基因原核表达载体的构建

2.2.6目的基因在大肠杆菌中的高效表达及纯化

2.2.7蛋白的复性及生物活性检测

3结果

3.1重组质粒的双酶切及PCR鉴定

3.1.1 CaIFN-γ-T及PJLA605-CaIFN-γ重组质粒鉴定

3.1.2 CaIL-2-T及PJLA605-CaIL-2重组质粒鉴定

3.2重组质粒克隆基因的序列分析

3.2.1重组质粒IFN-γ基因的序列分析

3.2.2重组质粒IL-2基因的序列分析

3.2.3各种动物IL-2及IFN-γ基因的同源性比较

3.3重组蛋白的表达及最佳表达时机的确立

3.4工程菌的高效表达

3.4.1 IFN-γ工程菌的高效表达

3.4.2 IL-2工程菌的高效表达

3.5包涵体的提取及目的蛋白的纯化

3.5.1包涵体的提取

3.5.2目的蛋白的纯化

3.5.3复性的IL-2蛋白生物活性检测

4 讨论

4.1犬IFN-γ和IL-2基因的扩增和序列分析

4.2目的基因在原核细胞中的理想表达

4.3表达产物的处理及生物活性的检测

5结论

致谢

参考文献

附录1实验技术路线

附录2犬IFN-γ和IL-2基因克隆及表达载体构建图

附录3各种动物IL-2及IFN-γ基因的同源性比较

攻读硕士学位期间发表的学术论文