绵羊梅迪-维斯纳病毒核酸疫苗的制备及免疫学研究

摘要

Maedi-Visna病毒(Maedi-Visnavirus，MVV)是反转录病毒科慢病毒属的成员之一，主要侵染宿主的单核/巨噬细胞系的细胞，以损害绵羊的多种器官为特征。临床上以绵羊严重消瘦、呼吸困难、麻痹、跛行、由淋巴组织增生而致乳腺硬化、间质性进行性肺炎等为特征。梅迪—维斯纳病最早于1915年在美国的蒙大拿被发现，目前呈世界性分布。该病潜伏期长，可通过母羊哺乳及呼吸道和消化道广泛传播，无有效的药物和疫苗对其进行防制。从60年代后期开始，我国有报道绵羊梅迪—维斯纳病的发生，并于1984年首次从血清学角度确定了该病在我国的存在，1985年从血清学阳性的绵羊体内分离到该病毒。该病的传播对绵羊养殖业造成了严重的危害。本实验鉴于此原因对我所保存的MVV毒株进行序列分析，并与该病毒其他毒株进行了序列比较，及对其核酸疫苗进行了免疫学研究，以确定该病毒的来源，对该病的防制奠定了基础。 MVV基因的克隆目的：对保存的来源于美国的MVV毒株(暂时用MVV-am表示)的基因进行克隆、测序及序列分析，通过与原美国株MVV-85/34和亲本株MVV-1514相比，确定其变异率，同时为其核酸疫苗的研究搭建平台。方法：根据Genbank中发表的绵羊梅迪-维斯纳病毒美国株85/34的基因组序列(检索号：AY101611)设计合成了4对引物，用蛋白酶K法提取MVV前病毒DNA，对主要基因片段进行PCR扩增，并对扩增产物进行了克隆和测序。结果：与原美国株MVV-85/34相比，MVV-am在传代过程中发生了变异，变异率约为3.1％。其中MVV-am的LTR和pol基因相对变异较大，gag基因核心部分变异相对最小。和亲本株MVV-1514相比变异较大，同源性约为90.1％，且发生了核苷酸的缺失。结论：我们保存的来源于美国的MVV毒株与原美国株MVV-85/34相比，核苷酸发生了变异，同源性大约为96.9％。而与亲本株MVV-1514相比，核苷酸变异相对较大。 MVV主要保护性抗原基因的克隆和序列分析目的：针对MVV的主要保护性抗原gag基因(P51)进行克隆、序列分析及抗原性分析，以明确其抗原性，为MVV核酸疫苗的构建奠定分子基础。方法：根据国外发表的MVV美国株的gag基因及其核心片段的核苷酸序列设计引物，从MVV前病毒DNA中扩增gag基因片段，将其插入到pEGM-Teasy克隆载体中，构建重组质粒pEGM-T-gag，转化大肠杆菌DH5α后，筛选阳性克隆进行序列测定和比较分析。利用ATHENPROT软件对其抗原性进行比较和分析。结果：本实验所克隆的gag基因与MVV美国株gag基因的核苷酸和氨基酸的同源性为别为98.2％和96.9％；gag基因核心片段编码蛋白的抗原性与MVV-85/34及MVV-1514株基本一致。结论：克隆得到gag基因片段，且该基因编码蛋白具有较高的抗原性。 MVV核酸疫苗真核表达载体的构建及表达目的：构建MVV核酸疫苗pcDNA5/TO-gag并转染COS-7细胞，检测核酸疫苗和重组质粒在真核细胞中瞬时表达的情况。方法：将克隆的gag基因片段亚克隆到真核表达载体pcDNA5/TO中，构建了MVV核酸疫苗pcDNA5/TO-gag。将上述质粒以及空载体pcDNA5/TO用脂质体介导法转染COS-7细胞48小时后，经免疫组化、ELISA、westernblot及RT-PCR等方法检测重组质粒在COS-7细胞中的表达。结果：免疫组化发现重组质粒pcDNA5/TO-gag转染的COS-7细胞在细胞核周围呈现棕色，说明重组真核表达质粒pcDNA5/TO-gag在COS-7细胞中有相应蛋白的表达，而pcDNA5/TO转染的COS-7细胞没有出现棕色，说明没有相应蛋白的表达；用ELISA方法检测上述转染细胞裂解液上清发现，pcDNA5/TO-gag转染组为阳性，而pcDNA5/TO为阴性，表明所克隆的保护性抗原基因可以在COS-7细胞中表达；RT-PCR检测发现pcDNA5/TO-gag转染组提取细胞mRNA后，经RT-PCR扩增后出现大小约800bp的目的条带，与gag基因核心片段大小相符，而pcDNA5/TO和对照组没有检出相应条带。Westernblot检测可见大小约27ku的目的条带，与预期结果相符。结论：MVV核酸疫苗pcDNA5/TO-gag可以在真核细胞中瞬时表达。 核酸疫苗接种小鼠诱导的免疫反应目的：将构建的含有MVV核酸疫苗pcDNA5/TO-gag单独或用脂质体作为佐剂共免疫小鼠，通过评价其诱导的体液和细胞免疫应答，探讨核酸疫苗的效果及脂质体的免疫佐剂作用。方法：pcDNA5/TO-gag、pcDNA5/TO-gag和脂质体、及pcDNA5/TO分别免疫BALB/C小鼠，通过MTT比色法检测免疫后第2、4和6周小鼠淋巴细胞的转化值，用间接ELISA法检测免疫小鼠血清MVV抗体产生水平及小鼠淋巴细胞IL-4和IFN-γ的分泌水平。结果：pcDNA5/TO-gag和脂质体免疫组的淋巴细胞转化值最高，且pcDNA5/TO-gag单独免疫组的淋巴细胞转化值与对照组亦有显著差异(P＜0.05)；通过对免疫小鼠血清的ELISA实验发现，pcDNA5/TO-gag和脂质体组的抗体滴度最高，而免疫组与对照组间有显著差异(P＜0.05)；通过对小鼠淋巴细胞分泌的IL-4和IFN-γ检测发现，pcDNA5/TO-gag和脂质体组的小鼠淋巴细胞IL-4和IFN-γ分泌水平高于单独免疫组，单独免疫组与对照组也有显著差异(P＜0.05)。结论：本实验所构建的含有MVVgag基因的核酸疫苗免疫小鼠后可诱导特异性体液和细胞免疫应答，核酸疫苗具有免疫反应性。脂质体对MVV核酸疫苗具有明显的免疫佐剂作用。 羊IL-2对MVV核酸疫苗免疫效果的影响目的：构建含有IL-2基因的真核表达载体，转染COS-7细胞确定其在真核细胞中能够瞬时表达，与核酸疫苗pcDNA5/TO-gag共免疫小鼠，检测其免疫佐剂效应。方法：用PCR方法从pBV220/IL-2质粒中扩增IL-2基因，并亚克隆至真核表达载体pcDNA5/TO，构建真核表达质粒pcDNA5/TO-IL-2。pcDNA5/TO-IL-2转染COS-7细胞后48小时后，用山羊IL-2检测试剂盒以ELISA方法及RT-PCR方法检测pcDNA5/TO-IL-2在COS-7细胞中的瞬时表达情况。将重组质粒pcDNA5/TO-IL-2与pcDNA5/TO-gag同时免疫BALB/C小鼠后，用MTT比色法检测特异性淋巴细胞转化值、ELISA方法检测抗体滴度及淋巴细胞的IFN-γ和IL-4的分泌水平。结果：pcDNA5/TO-IL2组转染的COS-7细胞裂解物上清ELISA反应为阳性，pcDNA5/TO组为阴性；经RT-PCR方法检测转染细胞的mRNA，pcDNA5/TO-IL-2组有500bp的目的片段出现，而pcDNA5/TO组未扩增出该大小的片段。pcDNA5/TO-IL-2与pcDNA5/TO-gag联合免疫组的淋巴细胞转化值最高，且与对照组有显著差异(P＜0.05)；通过对免疫小鼠血清的ELISA实验发现，pcDNA5/TO-IL-2与pcDNA5/TO-gag联合免疫组的抗体滴度较pcDNA5/TO-gag单独免疫组略有上升，而免疫组与对照组间有显著差异(P＜0.05)；通过对小鼠淋巴细胞分泌的IL-4和IFN-γ检测发现，pcDNA5/TO-IL-2与pcDNA5/TO-gag联合免疫组小鼠淋巴细胞IFN-γ分泌水平明显高于其他组，而IL-4水平略高于pcDNA5/TO-gag单独免疫组，而单独免疫组与对照组相比有显著差异(P＜0.05)。结论：本实验成功构建的重组质粒pcDNA5/TO-IL-2可以在COS-7细胞中表达，IL-2与核酸疫苗pcDNA5/TO-gag共同免疫小鼠可以刺激小鼠脾淋巴细胞增殖并使小鼠淋巴细胞分泌高水平的IFN-γ，而抗体和IL-4升高程度不显著，证明IL-2是MVV核酸疫苗良好的免疫佐剂，并且以细胞免疫为主。

目录

文摘

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1引言

2材料与方法

3结果与分析

4讨论

5结论

致谢

参考文献

附录

攻读博士期间发表的学术论文