鸭和鹅A型禽流感间接ELISA抗体检测方法的建立

摘要

鸭、鹅等水禽不仅是AIV的巨大储存库和传染源在禽流感的传播中发挥重要作用，而且可自然感染HPAIV发病并且死亡。我国是世界养禽大国，也是世界主要鸭、鹅养殖地，禽流感的检测，尤其是水禽流感的检测，不仅直接关系到我国鸭、鹅养殖业能否健康、快速发展，而且关系到世界范围内禽流感的防控和人类公共卫生安全。 本试验以改良氯仿抽提法提纯鸭、鹅卵黄免疫球蛋白，制备并纯化兔抗鸭、兔抗鹅抗体为基础，通过质量鉴定，选择最优HRP标记IgG的制备和纯化方法，再以此HRP标记兔抗鸭和兔抗鹅IgG及纯化原核表达的AIV的M1、NP为基础，通过各种条件的摸索，分别建立了鸭和鹅A型禽流感抗体检测的M1-ELISA和NP-ELISA，并对此ELISA体系进行评价。 试验表明：改良氯仿抽提法适于鸭和鹅卵黄免疫球蛋白的提纯，提纯的IgY和IgY(△Fc)纯度均＞90％、活性均＞1：64；制备并纯化的兔抗鸭和兔抗鹅IgG的效价均＞1：16、纯度均＞90％、亲和力均＞109，基本满足制备酶结合物的标准；调节PH法优于乙二醇封闭法，可较好的防止HRP过分醛化和自身交联；HRP标记IgG的最佳纯化法为G200与50％X酸铵盐析相结合的方法。本试验以制备的HRP标记兔抗鸭和兔抗鹅IgG的摩尔比均在1.5～2.0之间，结合物产率均＞40％，酶活性均＞1000U，使用浓度均＞1：1000。 本试验建立了NP-ELSIA和M1-ELISA鸭A型AI抗体检测方法，对鸭肝炎、鸭瘟血清的检测均为阴性，且可分别被NP和M1阻抑；对H5和H7亚型AI抗体检测的敏感性分别为1：6400和1：6400、1：3200和1：1600，对H9亚型AI抗体的检出为阴性和弱阳性/阴性；板间和板内变异系数分别为3.0％和9.1％、4.5％和7.9％。表明NP-ELSIA和M1-ELISA对H5和H7鸭A型AI抗体检测具有高特异性、敏感性和重复性，NP-ELSIA优于M1-ELISA。本试验建立了NP-ELSIA和M1-ELISA鹅A型AI抗体检测方法，对鹅副黏病毒病、小鹅瘟血清的检测均为阴性，且可分别被NP和M1阻抑；对H5、H7和H9亚型AI抗体检测的敏感性分别为1：3200和1：800、1：12800和1：3200、1：800和1：200；板间和板内变异系数分别为4.8％和7.3％、3.9％和6.7％。表明NP-ELSIA和M1-ELISA对H5和H7鹅A型AI抗体检测具有高特异性、敏感性和重复性，NP-ELSIA优于M1-ELISA。 M1-ELISA和NP-ELISA鸭、鹅A型AI抗体检测技术可用于我国鸭、鹅养殖业禽流感的检测、疫苗免疫效果的监测及免疫程序的制定，对于我国鸭、鹅养殖业的健康快速发展起到直接的推动作用。此法还可用于鸭、鹅禽流感的血清学监测，对于我们了解水禽的禽流感史、AIV的生态学分布及世界范围内禽流感的监控、预警、预报都有着重要的意义。另外，此法还为区分鸭、鹅A型AI的自然感染和人工免疫提供了技术储备。

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1前言

2材料与方法

3结果与分析

4讨论

5结论

致谢

参考文献

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