猪捷申病毒Swine/CH/IMH/03全长cDNA克隆的构建及其3D蛋白的表达

摘要

目前，反向遗传操技术是病毒基因工程疫苗、基因功能及致病机制研究等的一个有效工具，因此在病毒的研究中得到了广泛的应用。为了构建PTV感染性克隆，本试验将PTV中国分离株Swine/CH/IMH/03全长基因组的4个相互重叠片段分别克隆到pBluscript SK(+)载体中，然后通过序列拼接，最终获得了PTV全长基因组克隆(pSK-PTVFL)。测序证实，我们获得的pSK-PTVFL中PTV-1基因组5’端为poly(C)，后接非翻译区及开放阅读框(Open reading frame，ORF)，3’端为poly(A)。除此之外，本试验在PTV-1基因组5’端外引入了Kpn Ⅰ酶切位点，3’端外引入了Sac Ⅱ酶切位点，以便在体外转录时进行质粒线性化。Kpn Ⅰ下游引入了T7启动子，可以利用T7 RNA聚合酶进行体外转录合成RNA。概言之，我们获得全长克隆为：Kpn Ⅰ-T7 promotor-PTV genome-Poly(A)-Sac Ⅱ。 和亲本毒株Swine/CH/IMH/03及其他PTV毒株序列比对发现，该克隆的5’-UTR和3’-UTR和PTV各毒株高度同源，其中与Talfan的同源性为100％，保证了5’-UTR和3’-UTR序列的完整和精确。该克隆的ORF区存在3个核苷酸及氨基酸位点突变，分别位于2A、2C和3D基因中，可以用作亲本毒株与工程毒的鉴别。 同时，本试验对PTV Swine/CI-UIMH/03 3’-UTR及5’-UTR进行了克隆、测序及序列比对，发现PTV各毒株间的3’-UTR序列只有不到100个碱基，但极为保守，只有10个位点存在碱基替换。PTV Swine/CH/IMH/03的5’-UTR和其他PTV毒株高度同源，其中和Talfan毒株同源性为100％。 在上述构建PTV-1全长cDNA克隆的基础上，我们进行了PTV-1病毒挽救的工作，PTV-1病毒挽救进行了初步探讨。 PTV-1全长cDNA克隆的成功构建及我们积累的PTV-1挽救经验，为后期进行基于PTV反向遗传操作的病毒基因组结构、功能及疫苗的研究奠定了基础。 在PTV病毒中，3D蛋白是具有RNA依赖RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase，RDRP)活性蛋白，能介导机体产生特异性的抗体。在同科的口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus，FMDV)中，以3D蛋白作为诊断抗原已经建立了用于FMDV抗体检测的诊断方法，而且得到了广泛的应用。为了能够建立一种特异性的血清抗体检测方法，用于我国猪捷申病毒血清流行病学调查，本实验以pSK-PTVFL为模板，通过PCR扩增了PTV 3D蛋白基因，并将其克隆到原核表达载体pET30a(+)，用IPTG对含重组质粒的E.coli BL21重组菌进行了诱导表达，SDS-PAGE结果表明，3D蛋白获得了大量表达，薄层扫描表明表达的目的蛋白占菌体总蛋白的66.1％。Western blot显示，表达的3D重组蛋白能被猪抗PTV的阳性血清识别，这为基于PTV 3D蛋白的快速ELISA诊断试剂盒的研究奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

1引言

1.1猪捷申病及捷申病毒概述

1.1.1猪捷申病概述

1.1.2猪捷申病毒一般特征

1.1.3猪捷申病毒的诊断

1.1.4猪捷申病毒的免疫应答及疫苗研究

1.1.5猪捷申病毒的分子生物学特征

1.2反向遗传操作概述

1.2.1反向遗传操作策略

1.2.2反向遗传操作的应用

1.2.3反向遗传操作的局限性

1.3本研究目的和意义

1.4本研究的主要内容

2材料与方法

2.1猪捷申病毒Swine/CH/IMH/03株全长克隆的构建的材料与方法

2.1.1实验材料

2.1.2试验方法

2.2猪捷申病毒Swine/CH/IMH/03株3D蛋白原核高效表达及反应活性的材料与方法

2.2.1实验材料

2.2.2试验方法

3结果

3.1猪捷申病毒Swine/CH/IMH/03株全长克隆的构建

3.1.1 PTV-1 RT-PCR

3.1.2四个亚克隆的构建

3.1.3 pSK-PTV23的构建

3.1.4 pSK-PTV123的构建

3.1.5 pSK-PTVFL的构建

3.1.6全长克隆pSK-PTVFL的测序及序列分析

3.1.7全长克隆pSK-PTVFL与与亲本毒株的序列比对

3.1.8与所有捷申病毒全长序列的比对

3.2猪捷申病毒Swine/CH/IMH/03株3D蛋白的原核高效表达及反应活性

3.2.1 PTV 3D基因PCR

3.2.2重组质粒pET3D的PCR鉴定

3.2.3 3D重组蛋白的诱导表达

3.2.4 3D重组蛋白表达方式鉴定

3.2.5 3D重组蛋白表达条件的优化

3.2.6 3D重组蛋白纯化

3.2.7 3D重组蛋白Western Blot

3.2.8 PTV3D序列的比较分析

4讨论

4.1猪捷申病毒Swine/CH/IMH/03株全长克隆的构建

4.1.1构建策略及序列精确性

4.1.2 pSK-PTVFL与亲本序列Swine/CH/IMH/03的比对

4.1.3 poly(C)及poly(A)的获得

4.1.4克隆的稳定性

4.1.5 3'-UTR的变异性

4.1.6 5'-UTR的变异性

4.1.7多聚蛋白区的变异性

4.1.8 PTV-1病毒挽救的初步探讨

4.2猪捷申病毒Swine/CH/IMH/03株3D蛋白的原核高效表达及反应活性

4.2.1 3D蛋白的变异性

4.2.2 3D蛋白的应用前景

5结论

致谢

参考文献

攻读硕士期间发表的学术论文