猪圆环病毒1型Cap蛋白的原核表达及PCV-1/PCV-2抗体鉴别ELISA的建立

摘要

猪圆环病毒(Porcinecircovirus,PCV)是目前已知最小的动物病毒。根据PCV的致病性、抗原性及核菅酸序列，将其分为PCV-1和PCV-2两型。PCV-1广泛存在于猪体内及猪源传代细胞系中，经动物感染试验证明PCV-1无致病性，但与猪的健康密切相关，因此对该病原的研究十分必要。PCV-2与猪群中发生的多种疾病相关，如断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎肾病综合征、猪呼吸道疾病综合征及先天性震颤等，给全世界养猪业带来了巨大的经济损失。 本试验通过设计合成特异性引物，扩增PCV-1ORF2基因并进行原核表达，用所获得的Cap重组蛋白经纯化后作为包被抗原建立了一种敏感、特异、稳定性好的间接ELISA方法。 根据GenBank公布的PCV-1ORF2基因序列，设计并合成三对特异性引物，以PCV-1为模板经PCR扩增出三个ORF2基因片段，将其克隆到pMD18-T载体中。经过测序，将三段ORF2基因定向克隆至原核表达载体pGEX-6P-1上，然后转入表达宿主菌BL21中，获得了目的蛋白，分子量分别约为41Ku、40Ku、38Ku。通过Westernblot证明这三种重组蛋白均具有抗原性。 选用抗原性最好的且不与PCV-2标准阳性血清发生交叉反应的CapB重组蛋白作为包被抗原，通过优化反应条件建立了能检测血清中PCV-1抗体的间接ELISA。此外，用CapB蛋白和实验室已制备的PCV-2的Cap蛋白同时作为包被抗原，建立了一种能鉴别PCV-1和PCV-2的间接ELISA。用以上两种方法分别检测PRRSV、CSFV、PRV等病毒的标准阳性血清进行特异性试验，结果表明特异性良好；两种ELISA与免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)同时对92份血清样品进行检测，符合率分别为93.5％、96.7％；重复试验结果表明，变异系数都小于10％。应用以上两种方法对国内部分地区采集的227血清样品进行检测，结果有75份为PCV-1阳性，阳性率为33.04％。69份为PCV-2阳性，阳性率为30.4％，其中有7份为混合感染。

目录

文摘

英文文摘

声明

1 引言

1.1病原学研究进展

1.1.1病毒的发现

1.1.2病毒的理化特性及培养特性

1.1.3 PCV的基因组特征

1.1.4 PCV基因组的复制与转录

1.1.5病毒主要的编码蛋白

1.2流行病学

1.3 PCV-12相关的疾病

1.3.1断奶仔猪多系统衰竭综合征

1.3.2猪皮炎和肾病综合征

1.3.3繁殖障碍

1.3.4增生性坏死性肺炎

1.3.5先天性震颤

1.3.6猪呼吸道综合征

1.4诊断方法

1.4.1猪圆环病的临床诊断

1.4.2猪圆环病的病理学诊断

1.4.3猪圆环病毒的实验室诊断

1.5研究的目的和意义

2材料和方法

2.1材料

2.1.1实验动物

2.1.2质粒、载体、菌种、病毒、细胞

2.1.3主要试剂

2.1.4引物

2.1.5主要仪器设备

2.2方法

2.2.1 PCV-1 ORF2基因的原核表达及纯化

2.2.2检测PCV-1抗体的间接ELISA诊断方法的建立

2.2.3 PCV-1、PCV-2鉴别ELISA诊断方法的初步建立

3结果与分析

3.1 PCV-1 ORF2基因的原核表达及纯化

3.1.1 PCV-1 ORF2A、ORF2B、ORF2C基因的扩增

3.1.2重组克隆载体酶切鉴定

3.1.3 PCV-1 ORF2A、ORF2B、ORF2C基因核苷酸序列测定结果

3.1.4重组表达载体酶切鉴定

3.1.5重组蛋白表达及可溶性分析

3.1.6重组蛋白的纯化及Western blot结果

3.2检测PCV-1抗体的间接EIASA诊断方法的建立

3.2.1 CapA、CapB、CapC抗原性的比较

3.2.2阳性血清效价的检测

3.2.3抗原最适包被量与血清最适稀释度的确定

3.2.5工作条件的优化

3.2.6判定标准

3.2.7特异性试验

3.2.8敏感性试验

3.2.9批内重复试验

3.2.10与IPMA检测结果比较试验

3.2.11临床样品检测

3.3 PCV-1、PCV-2鉴别ELISA诊断方法的初步建立

3.3.1抗原最适包被量与血清最适稀释度的确定试验

3.3.2工作条件的优化

3.3.3特异性反应试验

3.3.4批内重复试验

3.3.5与IPMA检测结果比较试验

4讨论

4.1重组蛋白原核表达

4.1.1表达载体的选择

4.1.2原核表达条件的优化

4.1.3包涵体蛋白的纯化

4.2目的蛋白的选择及应用

4.3 PCV-1 Cap间接ELISA方法的条件优化

4.4 PCV-1 Cap间接ELISA诊断方法的判定标准及应用

5结论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文