猪骨髓间充质干细胞分离培养及其核移植胚胎发育潜能研究

摘要

本实验以不同的方法分离培养了猪骨髓间充质干细胞(pMSCs)，对分离培养的pMSCs生物学特性进行了分析，并以pMSCs为供核细胞进行了核移植实验，通过重构胚的体外发育能力研究了pMSCs的发育潜能：以人骨髓间充质干细胞(hMSCs)与猪卵母细胞构建了人-猪异种重构胚，研究了hMSCs异种重构胚的体外发育能力，同时还对比研究了两种重构胚在激活后的核形态变化。实验取得以下结果： 1.以1mg/ml胶原酶消化法分离培养PFs，和胰蛋白酶消化法相比，可更为有效地解离细胞，一般3～4d即可达70％～80％细胞汇合，因此可在较短的时间内成功地获取原代PFs。 2.本实验采用密度为1.077g/ml的淋巴细胞分层液进行密度梯度离心分离pMSCs，在同等时间内，相对于全骨髓贴壁筛选法，该方法所获得的贴壁细胞量多，pMSCs相对较纯。 3.本实验从形态学及细胞表面分子标记(Vimention和CD106标记呈阳性，而CD45标记呈阴性)来鉴定pMSCs，初步确定所培养细胞为骨髓MSCs。本实验体外培养的pMSCs增殖倍增时间(Td)为36.48h，分裂指数第4d达到峰值为23.6±4.7‰，10h的贴壁率为78.49±6.2％。 4.本实验选用了盲吸法对MⅡ期的猪卵母细胞进行去核，去核率为86.0±0.43％。 5.PFs与pMSCs重构胚的卵裂率(76.04±8.1％vs74.45±12.1％)和囊胚率(15.07±2.2％vs14.63±7.9％)无显著差异，pMSCs重构胚囊胚内细胞数略高于PFs重构胚与PA胚胎(p＞0.05)。 6.以hMSCs和pMSCs为供体细胞与猪MⅡ期去核卵母细胞进行核移植得到重构胚，并进行胚胎发育能力的比较，在72h之前，两者发育能力没有显著差异：但是在第7d时，hMSCs异种重构胚的囊胚率(3.2±0.7％)显著低于pMSCs重构胚(11.59±2.37％)(p＜0.05)。 7.实验检测了hMSCs-猪异种重构胚和pMSCs重构胚在核移植激活后的核形态变化过程。激活后2h，有39.39±10.6％的hMSCs-猪异种重构胚染色体处于凝集状态，而pMSCs重构胚为53.49±9.5％(p＞0.05)；在激活后6h，有55.26±8.3％的hMSCs-猪异种重构胚形成原核，pMSCs重构胚则为58.18±7.8％(p＞0.05)。 8.在胚胎发育第5d分别计数了hMSCs-猪异种重构胚各发育阶段的胚胎数。停滞在4-细胞期的hMSCs-猪异种重构胚占28.80±3.9％，而pMSCs重构胚及孤雌胚胎只有13.04±1.1％和14.06±1.5％(p＜0.05)。

目录

文摘

英文文摘

声明

1前言

1.1骨髓间充质干细胞(MSCs)的研究概况

1.1.1MSCs的定义

1.1.2MSCs的分离与培养

1.1.3MSCs的生物学特性

1.1.4MSCs表型鉴定方法

1.1.5MSCs的体外分化

1.1.6MSCs应用前景及存在的问题

1.2动物体细胞核移植的研究概况

1.2.1动物克隆技术

1.3影响体细胞核移植效率的因素

1.3.1供核细胞类型对核移植效率的影响

1.3.2供体细胞的细胞周期对核移植效率的影响

1.3.3受体胞质对核移植效率的影响

1.3.4核质相互作用

1.3.5核移植步骤对克隆效率的影响

1.4异种细胞核移植的概况

1.4.1异种细胞核移植的研究进展

1.4.2影响异种细胞核移植相关因素的机理探索

1.4.3动物异种核移植技术的应用前景

1.5本研究的目的和意义

2材料与方法

2.1实验材料

2.1.1实验动物与试剂

2.1.2主要器材

2.1.3主要试剂的配制

2.2实验方法

2.2.1猪胎儿成纤维细胞(PFs)的分离培养

2.2.2pMSCs分离培养及生物学特性测定

2.2.3猪卵母细胞体外成熟培养

2.2.4猪成熟卵母细胞的孤雌激活

2.2.5体细胞核移植

2.2.6体细胞核移植后重构胚核形态的观察

2.3数据处理

3结果与分析

3.1猪胎儿成纤维细胞(PFs)的分离培养

3.1.1PFs两种原代培养方法的比较

3.1.2PFs生长曲线的测定

3.2猪骨髓间充质干细胞(pMSCs)原代培养及生物学特性分析

3.2.1pMSCs两种原代培养方法的比较

3.2.2pMSCs表面标志测定

3.2.3pMSCs生长曲线的测定

3.2.4pMSCs分裂指数的测定

3.2.5pMSCs贴壁率的测定

3.3PFs与pMSCs重构胚发育能力的比较

3.3.1去核效率的检测

3.3.2PFs与pMSCs重构胚的体外发育

3.4人-猪异种核移植胚胎发育的初步研究

3.4.1hMSCs-猪异种重构胚的体外发育

3.4.2hMSCs-猪异种重构胚激活后2h和6h的核形态

3.4.3hMSCs-猪异种重构胚体外发育阻滞

4讨论

4.1核移植供体细胞的分离培养

4.1.1PFs的分离培养

4.1.2pMSCs的分离培养

4.2pMSCs生物学特性的分析

4.3关于去核

4.4供体细胞类型对核移植效率的影响

4.5供核细胞周期对核移植效率的影响

4.6hMSCs-猪异种重构胚的体外发育

4.7两种供核细胞核移植激活后2h和6h核形态的比较

4.8hMSCs-猪异种重构胚体外发育停滞情况

5结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文