奶牛隐性乳房炎无乳链球菌生物膜鉴定与药敏实验研究

摘要

无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)是引起奶牛隐性乳房炎的主要病原菌之一,细菌在乳腺组织内以游离及生物膜(BF)状态存在。所谓生物膜是指细菌吸附于物体表面后分泌粘性胞外聚合物,并在其中生长繁殖而形成的细菌群落。游离状态细菌常引起急性感染,而慢性感染则常由生物膜导致。目前,兽医领域在测定奶牛隐性乳房炎细菌药敏试验中,针对的均是游离状态的细菌。
　　本实验利用扫描电镜(SEM)观察证实隐性乳房炎奶牛乳腺组织中存在无乳链球菌生物膜;比较游离状态及生物膜状态下无乳链球菌的耐药性,为临床诊治奶牛隐性乳房炎感染提供相关依据。采集隐性乳房炎淘汰奶牛的奶样,进行细菌分离鉴定。奶牛宰杀后采取其乳腺组织,经2.5％戊二醛磷酸盐缓冲液(GAPBS)固定后,乙醇梯度脱水、干燥、镀膜后用扫描电镜观察。取无乳链球菌标准菌株,用MTT法测定无乳链球菌活菌数标准曲线。以医用缝合针为载体,MH肉汤为培养基,加入实验分离出的无乳链球菌,体外制备无乳链球菌生物膜模型,培养8d后,取出载体用扫描电镜观察。采用试管二倍稀释法测定氧氟沙星、红霉素和乳炎康对实验分离出的无乳链球菌的最小抑菌浓度(MIC).将载体加入到两组含有抗菌药物的试管中培养8h后,将第一组载体取出用扫描电镜观察,第二组用超声震荡器和漩涡器把载体上的生物膜制成悬浮菌液,再用MTT法测定其吸光度(OD)值,对照标准曲线计算存活的细菌数,并取对数以logcfu/ml表示。进一步用统计学方法定量分析抗菌药物对无乳链球菌生物膜的清除作用。
　　本实验从奶样中分离出无乳链球菌;并证明在乳腺组织中存在无乳链球菌生物膜;能够建立无乳链球菌生物膜模型。测定氧氟沙星、红霉素和乳炎康的MIC值分别为0.5μg/ml、1μg/ml和2g/ml。抗菌药物对无乳链球菌生物膜活菌数的影响与生理盐水对照组比较表明:当氧氟沙星、红霉素和乳炎康浓度为1MIC时,差异不显著(P>0.05),生物膜结构完整,生物膜呈成片状生长:当氧氟沙星、红霉素和乳炎康浓度为50MIC时,差异显著(P<0.05),生物膜结构被破坏,生物膜呈分散分布;当联合应用氧氟沙星与红霉素、氧氟沙星与乳炎康和红霉素与乳炎康各药浓度均为1MIC时,差异显著(P<0.05),生物膜结构松散变薄。结果表明,隐性乳房炎奶牛乳腺组织中存在生物膜;利用医用缝合针能够体外培养无乳链球菌生物膜模型:生物膜状态无乳链球菌的抗药性与游离状态的无乳链球菌差异显著;低药物浓度(1MIC)联合应用氧氟沙星与红霉素、氧氟沙星与乳炎康以及红霉素与乳炎康时,与生理盐水对照组相比,差异显著,扫描电镜结果显示生物膜结构松散、变薄。说明联合用药对生物膜作用比较明显。

目录

中文摘要

英文摘要

1 前言

1.1 奶牛乳房炎概述

1.1.1 奶牛乳房炎的类型

1.1.2 奶牛乳房炎的发病原因与影响因素

1.1.3 奶牛乳房炎的流行特点

1.1.4 奶牛乳房炎的诊断

1.1.5 奶牛乳房炎的防治

1.2 生物膜的概述

1.2.1 生物膜的形成

1.2.2 生物膜模型的建立

1.2.3 影响生物膜的因素

1.2.4 生物膜的致病性

1.2.5 生物膜的耐药性

1.2.6 生物膜的检测

1.2.7 生物膜的防治

1.3 实验研究的目的与意义

2 材料与方法

2.1 实验动物

2.2 实验药品及器材

2.2.1 实验药品

2.2.2 实验器材

2.3 实验方法

2.3.1 实验样品的采集

2.3.2 奶牛乳房炎病原菌的分离与鉴定

2.3.3 扫描电镜观察乳腺组织

2.3.4 抗菌药物最小抑菌浓度(MIC)的测定

2.3.5 无乳链球菌生物膜体外模型的建立与鉴定

2.3.6 无乳链球菌活菌数标准曲线的建立

2.3.7 抗菌药物对无乳链球菌生物膜的作用

2.4 数据的统计与分析

3 结果

3.1 奶牛隐性乳房炎病原菌的分离与鉴定结果

3.2 乳腺组织扫描电镜观察结果

3.3 抗菌药物对游离状态无乳链球菌MIC值的测定结果

3.3.1 氧氟沙星的MIC值

3.3.2 红霉素的MIC值

3.3.3 乳炎康的MIC值

3.4 无乳链球菌生物膜体外模型的建立与鉴定结果

3.5 无乳链球菌活菌数标准曲线的建立结果

3.6 抗菌药物对无乳链球菌生物膜作用的结果

4 讨论

4.1 奶牛隐性乳房炎病原菌的分离与鉴定

4.2 扫描电镜观察生物膜结构

4.3 MTT法测定活菌数的应用

4.4 无乳链球菌生物膜的耐药性

4.5 利用中草药治疗生物膜菌病的前景

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的论文